透骨消痛胶囊对毒胡萝卜素诱导的内质网应激(PEKR信号通路)介导的大鼠体外培养关节软骨细胞凋亡的影响

目的:观察透骨消痛胶囊对毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)诱导的内质网应激(PEKR信号通路)介导的大鼠体外培养关节软骨细胞凋亡的影响。方法:采用4周龄SD大鼠膝关节软骨建立软骨细胞体外培养体系,将培养的第3代软骨细胞分为空白组、模型组及透骨消痛胶囊高、中、低剂量组。空白组不进行干预;模型组及透骨消痛胶囊高、中、低剂量组先以2μmol·L^(-1)TG干预4 h,然后模型组更换为正常培养基,透骨消痛胶囊高、中、低剂量组分别更换为浓度为100μg·mL^(-1)、50μg·mL^(-1)、25μg·mL^(-1)的含透骨消痛胶囊培养基干预24 h。干预后以MTT法检测各组软骨细胞活性、以AnnexinⅤ-FITC/PI双染法流式细胞术检测各组软骨细胞凋亡率、以Western Blot法检测各组软骨细胞中激活转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)、结合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein,BIP)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶12(cysteine aspartate specific protease 12,Caspase12)和Caspase3的表达量。结果:(1)软骨细胞活性。5组软骨细胞吸光度比较,差异有统计学意义(0.428±0.009,0.226±0.028,0.345±0.025,0.301±0.035,0.269±0.033,F=39.462,P=0.000)。模型组吸光度低于空白组(P=0.000);透骨消痛胶囊高、中、低剂量组吸光度均高于模型组(P=0.000,P=0.000,P=0.022);透骨消痛胶囊中、低剂量组的吸光度均低于高剂量组(P=0.019,P=0.000);透骨消痛胶囊低剂量组与中剂量组比较,差异无统计学意义(P=0.085)。(2)软骨细胞凋亡率。5组软骨细胞凋亡率比较,差异有统计学意义[(3.270±0.231)%,(30.003±4.128)%,(12.383±0.933)%,(15.387±2.961)%,(20.143±3.472)%,F=37.560,P=0.000]。模型组软骨细胞凋亡率高于空白组(P=0.000);透骨消痛胶囊高、中、低剂量组软骨细胞凋亡率均低于模型组(P=0.000,P=0.000,P=0.001);透骨消痛胶囊低剂量组软骨细胞凋亡率低于高剂量组(P=0.007),透骨消痛胶囊高、低剂量组与中剂量组比较,差异均无统计学意义(P=0.216,P=0.063)。(3)软骨细胞内质网应激(PEKR信号通路)关键蛋白含量。5组软骨细胞中ATF4含量比较,差异有统计学意义(0.257±0.028,0.435±0.033,0.315±0.023,0.276±0.038,0.351±0.043,F=13.057,P=0.001)。空白组及透骨消痛胶囊高、中、低剂量组的ATF4含量均低于模型组(P=0.000,P=0.001,P=0.000,P=0.012);透骨消痛胶囊低剂量组的ATF4含量高于中剂量组(P=0.022);透骨消痛胶囊高剂量组的ATF4含量与透骨消痛胶囊中、低剂量组比较,差异均无统计学意义(P=0.188,P=0.229)。5组软骨细胞中BIP含量比较,差异有统计学意义(0.227±0.026,0.432±0.022,0.294±0.035,0.263±0.020,0.339±0.032,F=25.416,P=0.000)。空白组及透骨消痛胶囊高、中、低剂量组的BIP含量均低于模型组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.002);透骨消痛胶囊低剂量组的BIP含量高于中剂量组(P=0.006);透骨消痛胶囊高剂量组的BIP含量与透骨消痛胶囊中、低剂量组比较,差异均无统计学意义(P=0.185,P=0.072)。5组软骨细胞中Caspase12含量比较,差异有统计学意义(0.252±0.027,0.346±0.028,0.294±0.011,0.315±0.024,0.325±0.019,F=7.345,P=0.005)。模型组的Caspase12含量高于空白组(P=0.001);透骨消痛胶囊高剂量组的Caspase12含量低于模型组(P=0.018);透骨消痛胶囊中、低剂量组的Caspase12含量与模型组比较,差异均无统计学意义(P=0.126,P=0.277);透骨消痛胶囊中、低剂量组的Caspase12含量与高剂量组比较,差异均无统计学意义(P=0.277,P=0.126);透骨消痛胶囊中、低剂量组的Caspase12含量比较,差异无统计学意义(P=0.614)。5组软骨细胞中Caspase3含量比较,差异有统计学意义(0.265±0.028,0.380±0.017,0.317±0.026,0.304±0.019,0.333±0.022,F=10.507,P=0.001)。模型组的Caspase3含量高于空白组(P=0.000);透骨消痛胶囊高、中、低剂量组的Caspase3含量均低于模型组(P=0.006,P=0.002,P=0.029);透骨消痛胶囊中、低剂量组的Caspase3含量与高剂量组比较,差异均无统计学意义(P=0.496,P=0.387),透骨消痛胶囊中、低剂量组的Caspase3含量比较,差异无统计学意义(P=0.138)。结论:透骨消痛胶囊能抑制TG诱导的大鼠体外培养关节软骨细胞发生由内质网应激(PEKR信号通路)介导的细胞凋亡,其作用效果与药物剂量无明显关系。

透骨消痛胶囊中补肾柔肝药和活血祛风药治疗骨关节炎作用方式的计算机模拟比较

目的:从分子层面比较透骨消痛胶囊中补肾柔肝药和活血祛风药治疗骨关节炎(osteoarthritis,OA)的作用方式。方法:分别以透骨消痛胶囊中的补肾柔肝药和活血祛风药所含化合物及OA靶点蛋白质作为研究对象,利用描述符计算、分子对接、生物网络等计算机模拟方法,分析二者的化合物化学空间特征及中药-化合物-靶点网络特征。结果:补肾柔肝药和活血祛风药的化学成分在化学空间中有较大的重叠区域,但前者分布更广;在中药-化合物-靶点网络中,补肾柔肝药和活血祛风药的作用网络特征分布仅存在部分相似之处,其网络中每个化合物的平均作用靶点数分别为4.3和1.9,平均每个靶点分别与2.7个和1.5个化合物相关联。结论:在治疗OA时,透骨消痛胶囊中补肾柔肝药主要是通过混杂药物的作用方式起作用,而活血祛风药主要是通过组合药物的作用方式起作用。

从Wnt/β-catenin信号通路探讨透骨消痛胶囊对关节软骨的保护作用

目的:从Wnt/β-catenin信号通路观察透骨消痛胶囊对大鼠膝骨关节炎关节软骨的保护作用。方法:60只健康清洁级2月龄雄性SD大鼠,随机分为正常对照组、模型对照组和透骨消痛胶囊组,每组20只。模型对照组和透骨消痛胶囊组采用质4%木瓜蛋白酶双膝关节腔注射,成功复制骨关节炎模型后,透骨消痛胶囊组给予透骨消痛胶囊287.5 mg·kg^(-1),正常对照组和模型对照组给予相同剂量的生理盐水。给药2个月后,采用Western blot法观察各组关节软骨中含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-5(ADAMTS-5)、Wnt-4、β-catenin和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的表达。结果:与正常对照组比较,模型对照组ADAMTS-5、Wnt 4、β-catenin和MMP-13表达升高(P<0.05);与模型对照组比较,透骨消痛胶囊组ADAMTS-5、Wnt 4、β-catenin和MMP-13表达降低(P<0.05)。结论:透骨消痛胶囊对关节软骨的保护作用与其降低Wnt/β-catenin信号通路表达相关。

透骨消痛胶囊对膝骨关节炎大鼠软骨下骨Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的:探讨透骨消痛胶囊对膝骨关节炎大鼠软骨下骨Wnt/β-catenin信号通路表达的影响。方法:将60只SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、透骨消痛胶囊组,每组20只。除空白对照组外,其余大鼠采用改良Hulth法建造膝骨关节炎模型。空白对照组、模型对照组给予生理盐水灌胃,透骨消痛胶囊组给予10 mg·mL-1透骨消痛胶囊溶液灌胃。干预后,置于麻醉下取材,经RT-PCR、Western Blot分别检测软骨下骨中Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA与蛋白含量变化。结果:RT-PCR、Western Blot结果显示,与空白对照组比较,模型对照组大鼠软骨下骨中Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA与蛋白含量表达显著升高(P < 0.01);与模型对照组比较,透骨消痛胶囊组大鼠软骨下骨中Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA与蛋白含量表达显著降低(P < 0.01或P < 0.05)。结论:透骨消痛胶囊可通过调控改良Hulth法制备的膝骨关节炎大鼠模型软骨下骨中Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA与蛋白含量表达,从而延缓膝骨关节炎软骨下骨硬化。

透骨消痛胶囊干预骨质疏松性骨关节炎模型骨重建与炎症因子变化的研究

目的:分析透骨消痛胶囊对骨质疏松性骨关节炎模型骨重建与炎症因子的影响,为治疗骨质疏松性骨关节炎提供依据。方法:建立骨质疏松性骨关节炎大白兔模型,取模型兔与正常对照兔各6只比较,鉴定造模成功。再将正常对照组与模型对照组大白兔各12只用生理盐水灌胃,中药组大白兔12只用透骨消痛胶囊灌胃;维持4,8周时,每组各6只取材,检测血清骨重建关键因子、骨形成与骨吸收标志物以及股骨髁炎症因子蛋白。结果:中药组与模型对照组比较,碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶和骨保护素(OPG)、破骨细胞异化因子(RANKL)活性显著降低,OPG/RANKL比值显著升高(P <0.05或P <0.01);白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α显著降低(P <0.01或P <0.05)。结论:透骨消痛胶囊能下调过度的骨重建速率,调节异常骨代谢水平,降低炎症因子水平,改善骨关节的软骨下骨与软骨变化,延缓骨质疏松性骨关节炎进程。

透骨消痛胶囊对兔膝骨质疏松性骨关节炎模型软骨与软骨下骨结构的影响

目的:观察透骨消痛胶囊对骨质疏松性骨关节炎模型软骨与软骨下骨结构的影响,为探讨治疗该类型骨关节炎提供依据。方法:将18只新西兰大白兔分为正常组、模型组、中药组。除正常组外,其余2组先诱导骨质疏松,再建立膝骨关节炎模型。正常组与模型组给予生理盐水,中药组给予透骨消痛胶囊灌胃4周。HE和番红-固绿染色,光镜观察软骨结构;显微CT观察软骨下骨,分析骨小梁参数;扫描电镜观察软骨下骨微细结构。结果:模型组软骨损伤,基质蛋白多糖浅染,Mankin评分达中期损伤;软骨下骨骨小梁结构破坏,参数变化;胶原纤维等微细结构损伤。中药组软骨损伤减轻,基质深染,Mankin评分为早期损伤;软骨下骨骨小梁结构和参数改善;胶原纤维等微细结构改善。结论:透骨消痛胶囊能改善骨质疏松性骨关节炎模型软骨结构与基质病变,减轻软骨下骨微结构破坏,故可延缓该类型骨关节炎病理进程。

透骨消痛胶囊抑制大鼠骨关节炎软骨退变的实验研究

目的:探讨透骨消痛胶囊抑制骨关节炎软骨退变的机制。方法:将30只2月龄SPF级SD雄性大鼠按照随机数字表法分为空白对照组(10只)和模型组(20只)。模型组采用改良Hulth法建立大鼠骨关节炎模型,按照随机数字表法分为模型对照组和透骨消痛胶囊组,每组10只。透骨消痛胶囊组用透骨消痛胶囊溶液(10 mL·kg^-1·d^-1)灌胃,空白对照组、模型对照组连续等剂量生理盐水灌胃,持续12周。观察大鼠股骨髁软骨的整体形态学变化情况,另使用HE染色和甲苯胺蓝染色观察大鼠软骨形态结构及软骨蛋白多糖的表达,并用ELISA法检测滑膜组织中炎症相关因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β),以及基质金属蛋白酶-13(MMP-13)水平。结果:HE染色结果表明,空白对照组关节软骨表面光滑平整,软骨细胞排列规则,层次清晰;模型对照组软骨表面粗糙,软骨细胞排列紊乱,软骨细胞异常分化;透骨消痛胶囊组关节软骨表面比模型对照组完整,层次较为清晰,软骨细胞形态较好。甲苯胺蓝染色显示,空白对照组软骨染色呈紫红色,染色较深且均匀;模型对照组软骨染色明显变浅;透骨消痛胶囊组软骨染色较模型对照组深,染色相对均匀。ELISA法检测结果显示,模型对照组滑膜组织中TNF-α、IL-1β、MMP-13水平均高于空白对照组(P <0.05),透骨消痛胶囊组低于模型对照组(P <0.05),透骨消痛胶囊组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。结论:透骨消痛胶囊能有效抑制炎症反应所引起的关节软骨退行性病变,延缓骨关节炎病理进程。

透骨消痛胶囊对膝骨关节炎大鼠关节软骨Gαs、Gα(i)、Gα(pan)的影响

目的:探讨透骨消痛胶囊对膝骨关节炎大鼠关节软骨G蛋白偶联信号传导系统的影响。方法:2月龄清洁级雄性SD大鼠36只,喂养1周后,随机分为空白组12只和造模组24只。造模组在第1,4,7天双膝关节腔注射0.2 mL质量分数为4%的木瓜蛋白酶。造模成功后,抽签法随机分为模型组和透骨消痛胶囊组,每组12只。透骨消痛胶囊组按照3.6 g·kg^(-1)·d^(-1)的剂量灌服透骨消痛胶囊,空白组、模型组给予等量生理盐水。12周后取关节软骨,采用Western blot技术检测关节软骨中Gαs、Gα(i)、Gα(pan)蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组Gαs、Gα(pan)表达量下降,Gα(i)表达量上升,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,透骨消痛胶囊组Gαs、Gα(pan)表达量上升,Gα(i)表达量下降,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结论:透骨消痛胶囊可能通过激活G蛋白偶联信号传导系统,延缓关节软骨的退变。