三重四级杆液质法检测食品中毒黄素和米酵菌酸含量

旨在建立利用三重四级杆液相色谱质谱(UPLC-MS/MS)同时测定食品中毒黄素和米酵菌酸含量的方法。样品在80%甲醇水溶液体系中萃取,离心后上清液经QuEChERS EMR-Lipid净化处理,浓缩、复溶后,以0.1%甲酸水和乙腈为流动相经梯度洗脱,液质电喷雾离子源正负模式检测,使用外标法进行定量分析。实验结果显示,毒黄素和米酵菌酸在浓度为0.5~100μg/L的范围内表现出较好线性关系,线性线性相关系数r大于0.995,在不同基质多水平添加浓度下,回收率为86.8%~103.6%,相对标准偏差(RSD)小于5%,毒黄素方法检出限为0.1μg/kg,定量限为0.2μg/kg,米酵菌酸方法检出限为0.05μg/kg,定量限为0.1μg/kg。该方法灵敏度高、专属性好、准确可靠,适合食品中毒黄素和米酵菌酸含量的测定。

椰酵伯菌毒黄素的研究进展

椰毒伯克霍尔德菌是引起酵米面和银耳食物中毒的病原菌,毒黄素是此菌产生的一种毒素,近年来对毒黄素的分离提取进行了相关报道,其中毒机制从对呼吸链电子传递体的旁路作用、抑制乳酸脱氢酶同工酶活力、对动脉平滑肌张力的影响以及微核技术测其诱变实验的研究等不同角度进行了研究,另有研究发现用电子自旋共振技术观察毒黄素能够损伤小鼠组织和人血细胞自由基,本文就毒黄素的化学提取分离、中毒机制以及生理生化活性的研究进展进行综述。

毒黄素对小鼠肾脏毒性作用的超微病理观察

观察毒黄素对小鼠肾脏的超微病理改变,探讨毒黄素中毒的机理。小鼠腹腔注射毒黄素(1.5 mg/kg),2 h后取其肾皮质,应用电子显微镜观察其超微结构改变。电镜下可查见毒黄素主要损伤肾近曲小管上皮细胞的线粒体和毛细血管内皮细胞基底膜,表现为大量线粒体空泡化和毛细血管基底膜不匀性增厚。毒黄素可造成肾近曲小管上皮细胞和肾小球毛细血管内皮细胞的超微结构损伤,以线粒体和基底膜的损伤更为突出,为毒黄素的毒性作用提供超微形态学依据。

毒黄素对非小细胞肺癌A549细胞株作用的实验研究

目的研究毒黄素不同浓度和不同作用时间对非小细胞肺癌A549细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法分别取0.5、0.375、0.25和0.125μmol/L毒黄素作用于A549细胞(实验组),以不加毒黄素为对照组,分别培养24 h和48 h。采用CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测A549细胞增殖抑制率和凋亡率。划痕实验对比0.125μmol/L毒黄素组和对照组(0μmol/L毒黄素)在12、24和48 h细胞迁移率。结果 0.5、0.375、0.25和0.125μmol/L毒黄素组24 h细胞增殖抑制率分别为(93.51±3.69)%、(40.38±3.08)%、(23.54±2.58)%和(13.07±2.37)%,48 h为(90.53±3.58)%、(53.72±3.02)%、(34.44±3.10)%和(24.78±2.43)%。0.5、0.375、0.25和0.125μmol/L毒黄素组24 h细胞凋亡率分别为(78.68±2.22)%、(43.66±2.53)%、(20.81±2.59)%和(6.25±0.96)%,高于对照组的(1.57±0.52)%;0.5、0.375、0.25和0.125μmol/L毒黄素组48 h细胞凋亡率分别为(88.66±3.16)%、(59.86±2.81)%、(27.89±3.48)%和(9.91±1.33)%,高于对照组的(1.59±0.55)%。0.125μmol/L毒黄素组12、24和48 h细胞迁移率分别为7%、11%和16%,低于对照组相应的14%、26%和39%。结论毒黄素对A549细胞有明显增殖抑制和促凋亡作用,并呈时间和剂量依赖性,且可抑制A549细胞迁移活性。

毒黄素对黄嘌呤氧化酶作用的影响

利用从椰毒假单胞菌(Pseudomona cocovenenans)中所分离提取的毒黄素(toxoflavin)对黄嘌呤氧化酶(EC.1、2 3、2)作用的动力学试验表明,毒黄素是此酶的非必需激活剂,而且对以次黄嘌呤为底物的反应的激活作用明显高于以黄嘌呤为底物的反应。此激活作用属于部分混合型。这一结果为探寻毒黄素对人体的致毒机理提供了一条重要线索。

用电子自旋共振技术观察毒黄素对小鼠组织和人血细胞自由基生成的影响

用电子自旋共振波谱技术观察到小鼠毒黄素中毒后，其心，肝，肾等组织中的自由基液度增高。同时发现，毒黄素体外染毒，使人血白细胞呼吸爆发功能丧失。

毒黄素对哺乳动物线粒体呼吸链电子传递的旁路作用

制备了含有较高NADH—Q氧化酶和琥珀酸氧化酶活力的猪心肌制剂(HMP)。当加入NADH为底物并以抗霉素A或鱼藤酮抑制酶活力时。加入毒黄素可使耗氧恢复至原来的1/3。在此耗氧之前先有一短暂的放氧过程。而琥珀酸的加入则看不到上述变化。因而证明毒黄素的作用限于NADH—Q氧化酶这一段上。将HMP加热之后再加入毒黄素无此效应,证明此为酶促过程。作者推测毒黄素可能促进O_2^-的歧化作用;并作用于NADH—Q氧化酶中的某个铁硫中心而参与或促进F_e^(2+)参加的Fenton反应以产生H_2O_2而表现毒性。

毒黄素对血清乳酸脱氢酶同工酶的影响

目的探讨毒黄素对某些器官的中毒机理。方法利用从酵米面椰毒假单胞菌（Ｐｓｅｕ－ｄｏｍｏｎａｃｏｃｏｖｅｎｅｎａｎｓ）中所分离提取出的毒黄素（Ｔｏｘｏｆｌａｖｉｎ）对１８例人血清中的乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）及其同工酶进行测定。结果乳酸脱氢酶总活力下降，ＬＤＨ１受抑制，活性下降，差异显著。结论毒黄素可抑制心肌能量供应。

毒黄素与米酵菌酸中毒的解毒研究

酵米面与变质银耳中毒是由椰毒假单胞菌引起的。此菌产生两种毒素:毒黄素和米酵菌酸。本研究显示以含维生素E的饲料饲喂小白鼠7天,可保护动物使之耐受毒黄素2μg/g体重的腹腔注射,使之不发生中毒,而喂正常饲料的小鼠在此毒素剂量攻击下全部死亡。超氧化物岐化酶与触酶只有当静脉注射时才有治疗毒黄素中毒的效果,还原性谷胱甘肽与维生素C则无效。试验了二巯基丙醇与半胱氨酸对米酵菌酸中毒的疗效,前者明显有效,可使腹腔注射米酵菌酸(1.2μg/g体重)的小鼠绝大部分存活,而未治疗的或用半胱氨酸治疗的小鼠则绝大部分死亡。由此提示,此菌中毒可用二巯基丙醇和维生素E来治疗。

SIRT1阻滞剂毒黄素对肺鳞癌细胞株SK-MES-1增殖、凋亡及迁移的影响

目的研究毒黄素在不同浓度和作用时间对肺鳞癌细胞SK-MES-1增殖、凋亡和迁移的影响。方法取浓度分别为1.0、0.75、0.50、0.25μmol/L毒黄素作用于SK-MES-1肺鳞癌细胞,以不加毒黄素为对照组,培养24和48 h。分别用CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测细胞生长抑制率和凋亡率。划痕实验对比0.25μmol/L剂量组和对照组在12、24、48 h细胞迁移率。结果在同一毒黄素浓度下,24 h细胞生长抑制率和凋亡率明显小于48 h。在同一时间点,随着毒黄素浓度升高,SK-MES-1肺鳞癌细胞生长抑制率和凋亡率逐渐升高,且都在毒黄素浓度为1.0μmol/L时达到最大值;实验组各时间点SK-MES-1肺鳞癌细胞在12、24、48 h的细胞迁移率明显小于对照组。结论毒黄素对SK-MES-1肺鳞癌细胞有明显生长抑制以及促凋亡作用,并表现出时间和剂量依赖性。毒黄素可抑制SK-MES-1肺鳞癌细胞迁移活性。

椰毒假单胞菌的毒黄素对免疫细胞的毒性及解毒作用研究

为了进一步探讨酵米面中毒病原菌——椰毒假单细胞菌的毒黄素对免疫细胞的毒性及解毒作用,我们利用~3H—TdR掺入DNA法检测了不同浓度毒黄素对免疫细胞的毒性作用和7种药物的解毒作用。结果显示,0.5μg/ml以上剂量的毒黄素,CPM值显著下降,而0.1μg/ml剂量的毒黄素出现了CPM值的明显回升,还肉眼观察了毒黄素对免疫细胞的影响。从药物对毒黄素的解毒作用看出,SOD、还原性谷胱甘肽、细胞色素C和维生素C作用快而持久,具有明显缓解毒黄素对淋巴细胞的申毒作用。

毒黄素的毒性与活性氧的关系

以三株白血病细胞培养与毒黄素作用,用~3H胸苷参与法测定毒黄素的生长抑制效应。对L7712细胞,0.1μg/ml毒黄素可达67.2±8.4％的生长抑制。抑制作用维持18h此后减弱。未见毒黄素使此细胞发生脂质过氧化作用。试验了各种化合物对毒黄素抑制细胞生长的影响。发现触酶,超氧化物歧化酶,甘露醇,二甲亚砜对毒黄素的细胞毒作用没有影响。ATP和丙酮酸盐可部分缓解毒黄素的生长抑制作用。还原性谷胱甘肽则明显缓解毒黄素的细胞生长抑制作用。对毒黄素的素性机理提出一些见解。

毒黄素致小鼠组织脂质过氧化作用

用椰毒假单胞菌产生的毒黄素注入小鼠腹腔引起急性中毒,约2h动物处于濒死状态。取脏器和血液以丙二醛法测定其脂质过氧化作用。显示肾和脑组织呈明显的脂质过氧化,而心脏、肺和血液未看到此种作用。考虑到毒黄素是作为还原性辅酶Ⅰ或FMNH_2与氧之间的电子传递体而产生H_2O_2的,因而推测产生H_2O_2的部位在线粒体和细胞浆,使线粒体受到损伤并影响糖酵解。

液相色谱串联四极杆线性离子阱质谱测定秸秆发酵饲料中米酵菌酸和毒黄素

本研究旨在建立利用液相色谱串联四极杆线性离子阱质谱(LC-MS/MS-QTRAP)测定秸秆发酵饲料中米酵菌酸和毒黄素的方法。秸秆发酵饲料样品用1%甲酸溶液+乙腈溶液(15+85)提取,经多重机制杂质吸附技术净化后,上LC-MS/MS-QTRAP测定,基质匹配外标法定量。结果表明:米酵菌酸和毒黄素在1~100μg/mL内线性关系良好,其相关系数>0.9950;方法检出限为0.7μg/kg和1.5μg/kg,定量限为2μg/kg和5μg/kg;在5、10μg/kg和100μg/kg 3个标准浓度添加水平下,平均回收率为82.8%~102%,相对标准偏差为1.8%~14.7%。应用此方法对50份不同来源的秸秆发酵饲料样品进行了检测,其中6份样品中检出米酵菌酸或毒黄素,其含量为3.5~56.7μg/kg,本研究建立的方法可用于秸秆发酵饲料中米酵菌酸和毒黄素含量的检测分析。

毒黄素对大鼠离体尾动脉平滑肌收缩作用的影响

目的观察毒黄素（Ｔｏｘｏｆｌａｖｉｎ，ＴＸＦ）对大鼠血管平滑肌的影响。方法应用张力试验方法测定毒黄素对离体大鼠尾动脉的影响。结果毒黄素对大鼠离体尾动脉的基础张力没有影响，但可增强氯化钾（ＫＣｌ）的缩血管作用。ＴＸＦ同样可增强去氧肾上腺素（Ｐｈｅ）的缩血管作用。结论ＴＸＦ可增强ＫＣｌ和Ｐｈｅ的缩血管作用。

钙离子和抗氧化剂对毒黄素缩血管作用的影响

目的探讨毒黄素（Ｔｏｘｏｆｌａｖｉｎ，ＴＸＦ）增强大鼠离体尾动脉收缩力的作用机制。方法应用张力试验方法测定钙离子、抗氧化剂等在大鼠尾动脉对毒黄素作用的影响。结果ＴＸＦ的作用对细胞外钙有依赖性，并可被钙通道阻断剂硝苯吡啶所阻断。过氧化氢酶（Ｃａｔａｌａｓｅ，Ｃａｔ）和过氧化物歧化酶（ＳＯＤ）不影响ＴＸＦ对血管的作用，表明ＴＸＦ的作用不受氧自由基的影响。ＴＸＦ不影响咖啡因和Ｕ４６６１９引起的血管收缩。结论ＴＸＦ对平滑肌的作用可能是通过对钙通道的影响产生，这种影响取决于血管组织的收缩状态。

毒黄素对黄嘌呤氧化酶作用的影响

利用从椰毒假单胞菌(Pseudomona cocovenenans)中所分离提取的毒黄素(toxoflavin)对黄嘌呤氧化酶(EC.1.2.3.2)作用的动力学试验表明,毒黄素是此酶的非必需激活剂,而且对以次黄嘌呤为底物的反应的激活作用明显高于以黄嘌呤为底物的反应。此激活作用属于部分混合型。这一结果为探寻毒黄素对人的致毒机理提供了一条重要线索。

水稻细菌性穗枯病菌分离条件的优化及产毒黄素观察

水稻穗枯病是水稻生产上重要的细菌性病害,目前针对其病原菌快速高效分离的体系很少有报道。本文以水稻细菌性穗枯病菌Burkholderia glumae标准菌株LMG2196为研究对象,探讨分析了B.glumae的生长温度、培养基上的菌落形态及对抗生素敏感性等。结果表明,选用含50μg/mL氨苄青霉素的KB平板划线,25℃培养36 h,可以快速高效分离B.glumae。B.glumae主要通过分泌毒黄素对寄主产生致病性,本文利用分光光度法测定了LMG2196菌株在不同温度以及营养条件下毒黄素的产生。LMG2196菌株在25～40℃之间均能产生毒黄素,在营养条件不同的LB和PPG液体培养基中,同一温度下,总体上表现为在PPG中产生的毒黄素要比LB中的多;且LB的最适产毒黄素温度是28～30℃,PPG的是37℃,表明毒黄素的产生与温度和营养条件有关。

流动注射化学发光法在线监测城市饮水中毒黄素突发性污染

基于碱性条件下毒黄素对鲁米诺-过氧化氢-纳米氧化铜化学发光体系光强的显著抑制作用,建立了一种在线监测和预警新方法。结合流动注射分析手段,通过微弱发光测量仪测定不同混合溶液光强。对4个影响因素进行单因素试验得出最佳结果,在此基础上经响应面优化各试验条件后进行标准曲线绘制及检出限测定,最后对不同水样进行加标回收。结果表明,该方法线性范围0.005~5.000mg/L,检出限0.001mg/L,加标回收率84%~114%。对浓度0.05 mg/L毒黄素平行测定11次,相对标准偏差(RSD)0.28%。该方法快捷便利,操作性强,可应用于城市饮水中毒黄素潜在突发性污染的快速在线监测和预警。

椰毒假单胞菌酵米面亚种及毒素的污染调查与湿米粉生产风险控制

本文研究了木耳、大米、淀粉及米面制品中椰毒假单胞菌酵米面亚种及其毒素的污染情况,并找出湿米粉生产风险控制的关键点。以生产企业、超市、农贸市场、餐饮单位为采样点,随机抽取生产环节132份样品,包括原料25份、成品11份和环境样品96份;流通环节食品样品144份,按照GB 4789.29—2020唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)进行检验,并结合VITEK2和MALDI TOF MS进行菌种鉴定和建立进化树;采用本实验室建立的液质方法同时检测食品样品中的米酵菌酸和毒黄素。研究结果表明,生产环节原料、成品和流通环节的食品样品共180份均未检出米酵菌酸和毒黄素,分离出唐菖蒲伯克霍尔德菌25株,主要来自于木耳和大米;生产环节中的96份环境样本中未检出唐菖蒲伯克霍尔德菌;分离菌株有四种产毒类型,分别为只产米酵菌酸、只产毒黄素、两种毒素均产和两种毒素均不产;其中6株为椰毒假单胞菌酵米面亚种,检出率为3%(6/276);两种毒素的产量与菌株的培养温度呈正相关,在培养温度为30℃时达到最高值;利用MALDI TOF MS图谱对分离菌株进行K类聚类分析,发现同一产地的大米有很高的亲缘性,可通过此方法对菌株进行溯源。说明木耳及大米较易受到椰毒假单胞菌酵米面亚种的污染,湿米粉生产过程中,企业应将原料间原料和其他生产车间进行有效分隔,防止成品受到原料粉尘或包装袋上微生物的二次污染;在流通环节中,采取低温的保存方式,可减少毒素的产生,最大限度降低或消除风险隐患。