河南省部分地区猪弓形虫感染调查及猪源虫株对小鼠的接种试验

目的了解河南省部分地区猪弓形虫感染情况和了解猪源弓形虫在小鼠体内产生与致病情况。方法IHA法、姬姆萨染色法和ELISA方法。结果在检查的2325份猪血清中,IHA方法查出304份为阳性,阳性率为13.1%;IHA抗体阳性血清抗体样品再以ELISA法检测循环抗原,查出23份为阳性;采集的脏器病料应用姬姆萨染色法检查滋养体,在3个猪群中镜检查到弓形虫滋养体。猪源虫株感染小鼠,第二代感染后第5天检测到IHA抗体,同时可在小鼠腹水内查到滋养体。结论河南省周口等7个地区猪弓形虫感染颇严重;猪源虫株接种小鼠试验可获成功。

刚地弓形虫529 bp重复序列环介导等温扩增检测方法的建立

目的 建立高效检测刚地弓形虫（Toxoplama gondii）的环介导等温扩增（LAMP）方法，为弓形虫病诊断提供新的技术手段。 方法 采用在线引物设计软件Primer Explorer 4.0设计弓形虫529 bp基因LAMP扩增引物，用已构建的pMD-19T-529 bp重组质粒为模板，建立LAMP扩增反应，通过添加环引物、设置不同浓度的甜菜碱和MgSO4以及不同反应温度对扩增反应体系和反应条件进行优化。以猪、微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）、猪等孢球虫（Isospora suis）的基因组DNA和超纯水为对照，pMD-19T-529 bp重组质粒为模板，分别进行优化后的LAMP和PCR扩增，评价LAMP方法的特异性。将pMD-19T-529 bp重组质粒梯度稀释为109~100 copies/ml，分别进行优化后的LAMP和PCR扩增，评价LAMP方法的灵敏性。 结果 设计的LAMP扩增引物可扩增出弓形虫529 bp序列保守区域的目的片段。优化结果显示，最佳反应总体系为25 μl，其中，甜菜碱最佳浓度为0.4 mol/L，MgSO4最佳浓度为6 mmol/L；添加环引物反应30 min的扩增效率与未添加环引物反应60 min的扩增效率相当，可使反应时间缩短30 min；最佳反应条件为63 ℃ 30 min，80 ℃ 3 min。特异性检测结果显示，所建立的LAMP方法可特异扩增弓形虫529 bp基因片段， 对照均未扩增出目的片段。灵敏性检测结果显示，LAMP方法的最低检出值达103 copies/ml，效率为PCR扩增（104 copies/ml）的10倍。 结论 建立了弓形虫529 bp重复序列的LAMP检测方法，该法具有较好的特异性和灵敏性。

弓形虫表面抗原SAG2重组蛋白的表达及纯化

目的在大肠埃希氏菌(E.coli)中表达弓形虫表面抗原2(SAG2),纯化制备重组蛋白rSAG2。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术从弓形虫基因组中扩增出SAG2编码基因片段,以pMD-18T质粒作TA克隆,序列测定后亚克隆入表达载体pGEX-4T-2,并转化E.coli JM109感受态菌,IPTG诱导表达rSAG2蛋白,重组rSAG2蛋白采用B-PER谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白纯化试剂盒纯化并进行SDS-PAGE与免疫印迹(Western-blot)鉴定。结果 SAG2编码基因扩增片段大小为469 bp;测序结果显示,克隆的SAG2基因序列与GenBank中弓形虫RH株的同源序列(序列号GI:161925)完全一致;所诱导表达的含GST的融合rSAG2蛋白大小约43kDa,纯化后的rSAG2经SDS-PAGE电泳显示一条纯化条带;蛋白免疫印迹结果显示rSAG2能够被兔弓形虫感染血清所识别。结论在大肠埃希氏菌中融合表达了弓形虫SAG2重组蛋白,纯化的rSAG2蛋白具有一定的免疫活性。