Amplification，cloning，sequencing and expression of the gene encoding the major surface antigen of Toxoplasma gondii isolated

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SAG1和IL-2基因佐剂混合免疫诱导鼠抗弓形虫感染的研究

目的 了解编码SAG1的重组质粒和IL 2基因佐剂在小鼠体内的免疫反应 ,评价该疫苗对弓形虫的保护作用。方法 编码SAG1的质粒和鼠源性IL 2表达载体以 10 0 μg的剂量免疫小鼠 ,3w后两次以相同的剂量加强免疫 ,分别以PBS和空质粒 pcDNA3 感染。采用ELISA法测定抗体水平、亚型、IFN γ和IL 4的含量 ,PCR及原位杂交检测感染鼠中DNA的整合及降解。所有鼠均由强毒力RH株弓形虫感染。结果 SAG1表达质粒 3次免疫后鼠体内特异IgG水平明显增高 ,IL 2表达质粒的联合使用导致IgG2a水平升高和IFN γ的产生。混合质粒注射的小鼠抗弓形虫感染的存活时间延长。结论 由SAG1DNA诱导的免疫应答因IL - 2表达质粒的共同注射而增强 。

弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 体外扩增弓形虫 RH株膜表面抗原 SAG1编码基因 ,构建原核表达质粒 ,并表达 SAG1编码基因序列。方法 收集、纯化 RH株速殖子 ,提取 RNA,据已知的 SAG1基因序列 ,在设计合成的 1对引物中引入 Eco RI和 Hind 酶切位点。应用 RT-PCR技术 ,扩增 SAG1基因片段 ,插入原核表达质粒 p ET2 8a中 ,转化大肠杆菌 BL2 1 感受态细胞 ,重组子经 Eco RI和 Hind 双酶切、PCR鉴定 ,转化宿主菌 BL2 1 ,并以 IPTG诱导表达。结果 从弓形虫 RH株 RNA中扩增出 10 1 1 bp的 SAG1基因片段 ,构建重组质粒 p ET2 8a/ SAG1 ,酶切和 PCR鉴定产物大小均与预期值相符 ;IPTG诱导 ,SDS-PAGE显示表达产物的大小约 3 4.8k D。结论 成功地从弓形虫 RH株 RNA中获取 SAG1基因 ,构建了 p ET2 8a/ SAG1重组质粒并获得了高效表达 。

弓形虫主要表面抗原基因( P30)大肠杆菌中以融合蛋白形式的初步表达(英文)

根据已发表的弓形虫主要表面抗原（ Ｐ３０）的基因序列，设计合成了一对引物，通过聚合酶链反应，扩增出 Ｐ３０ 基因，将 Ｐ３０ 基因克隆入表达质粒ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｅ Ｘ１ 中，经酶切鉴定后，阳性重组质粒转化宿主菌 Ｊ Ｍ １０９（ Ｄ Ｅ３ ），宿主菌经 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导表达后，产物进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ和 Ｗ ｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果显示， Ｐ３０ 基因以融合蛋白的形式表达，表达产物具有特异的免疫反应性。

弓形虫GJS株表面抗原1基因的克隆及真核表达质粒的构建

根据GenBank数据库中的RH株弓形虫表面抗原1(SAG1)基因序列设计1对引物,应用PCR技术从弓形虫GJS株速殖子基因组DNA中扩增编码SAG1的基因片段.PCR产物经纯化、酶切后定向插入pcDNA3.1(+)真核表达载体,转化至大肠杆菌DH5α,经酶切及PCR鉴定后测序,并进行序列分析.结果表明:从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增出1 008 bp的特异SAG1片段,大小与预测值相符,与已知的SAG1基因核苷酸序列(GenBank登录号:S76248)的ORF和氨基酸序列的同源性均为99%.

弓形虫主要表面抗原1截短型片段的克隆与表达

为构建弓形虫主要表面抗原1(SAG1)的原核重组表达质粒并获得重组表达蛋白,采用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫RH株基因组DNA中扩增SAG1基因,经克隆和测序后,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,PCR和双酶切鉴定阳性菌株,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定观察其诱导的抗体应答.结果表明,PCR扩增出SAG1基因的特异片段,获得的阳性克隆序列与GenBank中的SAG1基因序列一致,SAG1基因被亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,在BL21中表达了SAG1,表达的蛋白能被弓形虫感染兔血清识别.以上结果说明,已成功构建了弓形虫SAG1的重组表达质粒,在大肠杆菌中表达的SAG1具有良好的免疫学活性.

刚地弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1基因克隆、表达及抗原性分析

克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)丝裂原活化蛋白激酶1(TgMAPK1)基因片段,并分析其抗原性。提取弓形虫GT1株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。RT-PCR扩增TgMAPK1基因。扩增产物经双酶切后连接入pET28a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(Escherichia Coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以鼠抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。RT-PCR扩增产物约为1 599bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约58 000的包涵体重组蛋白。Western blotting分析证实其能被鼠抗弓形虫血清识别。刚地弓形虫GT1株TgMAPK1基因片段可在原核表达系统中表达,且该重组蛋白具有抗原性。

截短弓形虫表面抗原SAG2C的基因克隆、蛋白表达及其初步应用

目的克隆截短的弓形虫表面抗原SAG2C基因,在大肠埃希菌中表达SAG2C蛋白,并探讨其在弓形虫病诊断中的应用。方法对已知的弓形虫SAG2C基因序列进行部分取舍,用RT-PCR技术从弓形虫Prugniaud(PRU)株的总RNA中扩增截短的SAG2基因片段,插入载体pET32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达,应用Western blot和ELISA检测重组表达蛋白的免疫反应性。用重组SAG2C蛋白ELISA法检测弓形虫感染血清特异抗体,观察初步应用效果。结果从弓形虫PRU株总RNA中扩增出截短的SAG2C基因片段,成功构建了重组表达质粒pET32a(+)-tSAG2C;该重组质粒经IPTG诱导能表达可溶性大小为51ku的SAG2C蛋白。Western blot显示重组SAG2C能被弓形虫感染小鼠血清识别;以重组SAG2C蛋白、重组SAG1蛋白及BAG1蛋白ELISA检测精神病患者血清弓形虫抗体,阳性率分别为8.07%(23/285)、4.56%(13/285)和7.37%(21/285),差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建了重组质粒pET32a(+)-tSAG2C,表达的融合蛋白具有免疫反应性,具有用于弓形虫感染诊断的潜在价值。