THE ULTRASTRUCTURE OF TOXOPLASMA GONDII TACHYZOITES AND THE EFFECT OF USNIC ACID ON IT

The normal fine structures of toxoplasma gondii tachyzoite and the erfect of usnic acid on the ultrastructure of the tachyzoites were observed by transmission electron microscope (TEM).The studies indicate that the pathological changes or the ultrastructure of the parasite took place under the effect of the 10 mg/L usnic acid for 30 min.These changes can be illustrated as folio'vs; 1)The posterior portion of the rhopties were destroyed.2)The membrane of the daughter cell fractured. 3)The membranate organellae or the organisms were demaged.

扁桃酸对小鼠腹水中假包囊内弓形虫速殖子的作用

目的 观察扁桃酸治疗弓形虫感染小鼠腹水中假包囊及其内弓形虫速殖子形态结构的变化。方法 弓形虫RH株感染小鼠 ,扁桃酸 2 0 0mg·kg- 1,2次·d- 1,经口灌服和静脉注射给药 ,分别在 2 4h、72h和死亡后取腹水涂片 ,应用Giemsa染色和透射电镜观察弓形虫速殖子形态结构 ,并计算小鼠存活时间。结果 光镜下虫体细胞膜迂曲断裂 ,胞质中出现空泡和颗粒样物质 ,细胞核碎裂 ;电镜下虫体细胞膜、细胞器、细胞核的破坏更明显。扁桃酸治疗组小鼠存活时间 (口服组 8.0d ,注射组 6.8d)均明显长于阳性对照组 (5.5d ,P <0 .0 5)。结论 扁桃酸可透过假包囊而直接作用于其内的速殖子 。

弓形虫ROP2核酸疫苗免疫保护作用的研究

目的研究ROP2核酸疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法42只BALB/c小鼠随机分为3组:实验组、空质粒组和PBS对照组,各组小鼠分别肌注pc-DNA3-ROP2重组质粒50μg、pc-DNA3空质粒50μg和PBS50μl,共免疫3次,每次间隔3周,末次接种量均加倍。末次免疫后2周,各组分别取4只小鼠的血清、脾和淋巴组织,检测CD4+、CD8+及各细胞因子。其余各组每鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子500个,观察其存活时间等。结果ROP2核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,小鼠血清抗体滴度高并能识别由基因重组体外诱导表达的ROP2蛋白抗原;实验组小鼠的CD4+T细胞增殖明显(69.5±3.4)%、CD4+/CD8+比值显著升高(4.69±1.32)%(P<0.01);其脾、淋巴结细胞培养液及血清中白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-6、IL-12、γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)均有不同程度的升高,尤其是血清中升高最为显著。弓形虫攻击感染180h后,实验组小鼠免疫保护率为88.9%,与对照组相比,小鼠存活时间明显延长、初始死亡时间明显推迟(P<0.01)。结论ROP2核酸疫苗具有较强的免疫原性,能产生良好的免疫保护作用。

小鼠淋巴细胞体外抗弓形虫作用的实验研究

目的 :了解小鼠淋巴细胞体外抗御弓形虫速殖子的效果。方法 :采用大鼠脾细胞培养技术 ,以乙酰螺旋霉素作为阳性对照 ,观察淋巴细胞本身以及加入扁桃酸 (MA)后 ,对虫体侵入淋巴细胞及在淋巴细胞内增殖的影响。结果 :与其他体细胞相比较 ,淋巴细胞在受到弓形虫侵害时 ,仍可抑制和杀灭弓形虫。当存在免疫作用的情况下 ,安全剂量的MA抑制弓形虫侵入的作用不显著 ,但抑制细胞内弓形虫增殖的作用显著。结论 :以细胞介导的免疫作用是宿主抗弓形虫感染的重要因素 ,因此 ,应注重提高机体的细胞免疫 ,同时加用药物 。

弓形虫病病原的实验诊断研究进展

综述了诊断弓形虫病的方法,包括血清学试验、核酸检测(如PCR)、组织学检测寄生虫和/或其抗原(如免疫过氧化酶染色)或组织分离。其他较少使用的方法包括细胞培养、动物接种、弓形虫皮肤试验和抗原特异性淋巴细胞转化试验。论述了细胞培养、动物接种、血清学方法和核酸检测方法检测弓形虫的研究进展。

银杏酸、阿奇霉素和大蒜素抗弓形虫增殖效果研究

目的评价银杏酸、阿奇霉素和大蒜素体外和体内抗弓形虫增殖的效果。方法体外试验,培养HFF细胞做为弓形虫宿主细胞,采用MTT法检测3种药物的安全浓度和体外抗弓形虫增殖的效果。体内试验,以腹腔注射的方式给药,观察感染弓形虫小鼠的存活时间,比较3种药物的体内抗弓形虫增殖效果。结果银杏酸和阿奇霉素可显著抑制细胞内弓形虫的增殖,两者效果相近。银杏酸和阿奇霉素均可延长小鼠存活时间。大蒜素抗弓形虫效果微弱。结论银杏酸具有抗弓形虫作用。

松萝酸抗弓形虫速殖子作用的体外实验和电镜观察

目的：了解松萝酸在试管内杀弓形虫速殖子的效果及其机制。方法：将松萝酸（终浓度５－５０μｇ／ｍｌ）加入小鼠腹水中（含虫１×１０６个／ｍｌ），以螺旋霉素作对照。用光镜和透射电镜观察，并将药物作用４ｈ的速殖子接种于小鼠以观察虫体能否复苏。结果：经１０μｇ／ｍｌ松萝酸作用３０ｍｉｎ，即可见速殖子的棒状体后段中央部分被溶解，细胞膜相结构和子虫的细胞膜断裂。经５０μｇ／ｍｌ松萝酸作用４ｈ的虫体在小鼠体内未能复苏。螺旋霉素的杀虫效果不及相同浓度的松萝酸。结论：松萝酸在体外对弓形虫速殖子有杀灭作用，可以抑制速殖子的侵袭力和繁殖。该药的杀虫力与药物的浓度和作用时间呈正相关趋势。松萝酸的杀虫效果优于螺旋霉素。

扁桃酸对小鼠体内弓形虫速殖子的作用机制

目的探讨扁桃酸在小鼠体内抗弓形虫速殖子的作用机制。方法给予弓形虫感染的小鼠口服扁桃酸200 mg/kg,2次/d,然后在不同时间取腹水及肝脏制作电镜标本,观察弓形虫的超微结构变化。结果腹水中游离弓形虫速殖子和肝组织内弓形虫速殖子的超微结构均发生明显改变,细胞膜迂曲破裂,线粒体、内质网扩张破裂,棒状体肿胀破裂,致密颗粒减少或消失,核膜迂曲破裂,核固缩。扁桃酸实验组小鼠肝细胞的受损程度明显轻于阳性对照组和乙胺嘧啶药物对照组的肝细胞改变。结论通过形态学观察,发现扁桃酸的作用机制主要表现在其对虫体细胞膜、入侵细胞器及细胞核等结构的破坏,导致虫体崩解或抑制虫体的繁殖。

外源性花生四烯酸在弓形虫入侵巨噬细胞中的信号作用

目的 探讨花生四烯酸在弓形虫侵染巨噬细胞中的信号作用。 方法 采用普通光镜、流式细胞仪检测巨噬细胞的感染率 ;Fura 2 /AM染色 ,荧光分光光度法测定游离钙离子浓度。 结果 宿主细胞内钙离子浓度及巨噬细胞感染率随着外源性花生四烯酸浓度的增加而升高 ,并呈剂量依赖性关系。细胞外的钙离子内流 ,细胞内储存的钙离子释放 ,包括胞膜钙离子通道均在花生四烯酸的作用下 ,参与了胞内钙离子的升高。钙离子通道阻断剂对花生四烯酸作用前后的感染率的影响不明显。 结论 花生四烯酸可能通过钙离子作用于宿主细胞 ,增高其感染率。

弓形虫人源、畜源分离株的生化特性研究

本文采用弓形虫特异ＤＮＡ探针杂交技术，聚丙烯酰胺电泳，免疫印迹试验，色质谱分析对弓形虫人源分离的ＳＨ、Ｚｓ２株，猪源分离的ＣＮ，ＰＰ株，兔源ＲＴ株等１１个分离株在核酸、蛋白质、脂肪酸方面与国际标准人株ＲＨ株进行分子生化特性的比较与分析，实验结果表明用３２Ｐ标记弓形虫ＤＮＡ探针（１．１Ｋｂ）能与各虫株ＤＮＡ杂交，在２．０Ｋｂ位点上显示出明显的杂交带；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳蛋白质分子量范围在１－１２０ＫＤ间，以１４、１８、２２、３０、３５、３７、４１、４３、５２、７６ＫＤ为各虫株共有的条带，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，各虫株在３０、５２、７６ＫＤ均能被抗弓形虫ＩｇＧ识别；有机质谱仪检测脂肪酸组分中各虫株均有６种主要脂肪酸组成（ｃ１４一Ｃ１８）分别为肉豆蔻酸、棕榈油酸、软脂酸、硬脂酸、油酸和亚油酸，其中油酸和软脂酸占总脂肪酸含量的７０％，各虫株相对含量有所差异。实验结果为弓形虫分离株的生化特性和鉴定工作提供了科学理论依据。

弓形虫病分子诊断技术研究进展

弓形虫病是一种呈世界性分布的人兽共患寄生虫病,严重危害人类健康并给世界各国的畜牧业造成巨大的经济损失,但弓形虫病缺乏特异性临床症状,给该病的诊断带来很大困难。分子诊断技术的迅速发展为弓形虫病的诊断提供了快速、灵敏、特异及稳定的检测方法。笔者从核酸分子杂交技术、聚合酶链反应(PCR)、单克隆抗体(McAb)技术及生物芯片技术几个方面介绍了用于诊断弓形虫病的分子诊断技术的研究进展。

弓形虫pc-DNA3-ROP2核酸疫苗的研制

目的研究廉价有效的抗弓形虫核酸疫苗,以用于人类和畜类弓形虫病的防治。方法收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取基因组DNA;根据ROP2基因序列,设计合成ROP2基因引物,应用PCR、酶切、连接、测序等技术,扩增ROP2基因片段,克隆于真核表达载体pc-DNA3质粒中,制备抗弓形虫pc-DNA3-ROP2核酸疫苗。应用该疫苗免疫小鼠,通过ELISA检测血清抗体,Western blot鉴定该疫苗的免疫原性;应用RH株弓形虫进行动物攻击实验,评价其安全性及免疫保护性。结果以弓形虫基因组DNA为模板,PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段,克隆于pc-DNA3质粒中,成功构建了pc-DNA3-ROP2重组质粒。测序结果显示,重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列,能完整表达ROP2的抗原蛋白。应用该疫苗免疫小鼠,能诱导产生强烈的细胞、体液免疫反应,使实验组小鼠攻虫感染后的存活时间明显延长,攻虫感染192 h后的存活率为77.8%,空质粒及PBS对照组存活率为0,差异有统计学意义(P<0.001);实验全程免疫小鼠未发生毒性及异常反应。结论该核酸疫苗具有很强的免疫原性,安全可靠,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用,具有很好的开发应用价值。

DIG-DNA探针检测弓形虫核酸

应用ＰＣＲ技术，对弓形虫Ｂ１基因的部分序列进行体外扩增，获得２０７ｂｐ的特异性核酸片段，并通过地高辛配基（Ｄｉｇ－１１－ｄＵＴＰ）标记作为探针，通过斑点杂交试验检测弓形虫核酸。实验表明，该探针能与ＲＨ、ＳＨ１、ＺＳ１、ＺＳ２及ＧＬ１株弓形虫核酸特异性杂交，最低检测量为２５ｐｇ纯化弓形虫核酸。在急性感染弓形虫的小鼠，该探针可于感染后第２天（２４ｈ后），从组织（肝、脾、及肾）中检测到弓形虫核酸，第３天（４８ｈ后）可从部分小鼠（１／５）外周血中检测到弓形虫核酸。表明该探针具有特异、敏感、快速、实用的特点，可望用于弓形虫病的早期诊断，适用于基层及流行病学调查。

扁桃酸对感染小鼠腹水中弓形虫速殖子超微结构的影响

为探讨扁桃酸的杀虫机制 ,应用透射电镜观察扁桃酸对感染弓形虫小鼠治疗 2 4h、72 h和死亡后弓形虫速殖子的超微结构变化 ,扁桃酸 2 0 mg/ m l,0 .2 5 m l/只 ,2次 / d经口灌服和经尾静脉注射途径给药 ,同时用乙胺嘧啶5 mg/ ml,0 .2 5 m l/只 ,1次 / d作为药物对照。结果显示 ,扁桃酸在不同时期对弓形虫的超微结构均有破坏作用 ,且随药物作用时间延长 ,其杀虫作用增强。扁桃酸主要破坏虫体的细胞膜、细胞质中的线粒体、棒状体和内质网等 ,致密颗粒减少或消失。虽然乙胺嘧啶较扁桃酸对虫体的破坏程度稍强 ,但乙胺嘧啶在杀灭虫体的同时也破坏了腹水中正常细胞 ,而扁桃酸对正常细胞几乎无损伤。结果表明 ,扁桃酸的杀虫机制主要是破坏虫体细胞膜、细胞器和染色质 ,从而破坏了虫体赖以生存的理化环境和物质能量的代谢 ,破坏了虫体的遗传物质和遗传信息 ,抑制虫体的增殖。扁桃酸是高效低毒的抗弓形虫药物。

弓形虫影响前列腺素E_2合成的细胞内信号调节途径

目的 探讨弓形虫感染巨噬细胞过程中花生四烯酸 (AA)及前列腺素E2 (PGE2 )的产生及其相关的细胞内信号调节途径。 方法 构建刚地弓形虫 小鼠巨噬细胞侵染模型 ,应用气相色谱、酶联免疫吸附测定 (ELISA)、逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)检测钙离子调节剂乙二醇双 ( 2 氨基乙醚 )四乙酸 (EG TA)、钙离子螯合剂 (BAPTA/AM )、钙调蛋白抑制剂三氟拉嗪 (TFP)及蛋白激酶C (PKC)抑制剂 1 ( 5 磺酰基 ) 异喹啉 2 甲基 哌嗪盐酸盐 (H7)对弓形虫诱导的AA、PGE2 含量及促细胞分裂剂诱导性环加氧酶 2 (COX 2 )mRNA和蛋白质表达水平的影响。 结果 EGTA、BAPTA/AM及TFP均可抑制弓形虫诱导的巨噬细胞AA和PGE2 合成 ;PKC抑制剂H7可明显抑制弓形虫和脂多糖 (LPS)诱导的巨噬细胞PGE2 合成 ,并伴随着COX 2mRNA和蛋白质表达呈剂量依赖性减少。 结论 弓形虫侵染巨噬细胞过程可能通过钙信号转导途径调节COX 2底物AA的含量和PKC依赖的COX 2代谢途径调节PGE2 的合成。

用四环素诱导调控表达系统构建弓形虫脂肪酸合成酶FABZ缺陷株

目的构建基于四环素诱导调控表达系统的刚地弓形虫β-酮脂酰ACP合成酶(FABZ)缺陷株。方法从弓形虫基因组中扩增fabz基因并构建四环素调控诱导表达载体pTetO7-Sag1-FABZ-Ty-DHFR,电穿孔法导入弓形虫TATi株,通过乙胺嘧啶抗性和极限稀释法筛选FABZ缺陷株,蛋白质印迹(Western blotting)检测虫体内附加表位标签Ty的表达。在5×105个FABZ缺陷株弓形虫速殖子培养液中加入脱水四环素(终浓度为1μg/ml),Western blotting检测带有Ty标签的FABZ表达情况。结果筛选获得的缺陷株可表达带有Ty标签的转运肽型FABZ和成熟型FABZ。FABZ缺陷株弓形虫速殖子培养液中加入脱水四环素24 h和48 h后,转运肽型FABZ表达量均较对照组显著降低(P<0.05)。结论构建了由脱水四环素调控表达的弓形虫FABZ缺陷株。

免疫组织化学ABC法观察扁桃酸对小鼠急性弓形虫病肝脏病变的作用

目的用免疫组织化学ABC法观察扁桃酸治疗小鼠急性弓形虫病肝脏的病变,探讨扁桃酸对病变肝脏的保护作用。方法扁桃酸200mg/kg,2次/d,口服和静脉注射治疗弓形虫感染小鼠,同时设立乙胺嘧啶及扁桃酸药物对照组,治疗不同时间后取肝脏组织,常规制作病理切片,免疫组织化学ABC法常规染色。结果阳性对照组可见大量肝细胞坏死区,其内可见形态典型的弓形虫速殖子,扁桃酸治疗组仅见少量散在的黄染肝细胞,乙胺嘧啶对照组小鼠肝组织内也仅见少量散在的黄染肝细胞,但肝细胞受到明显的毒性损害。因而扁桃酸能有效地抑制弓形虫速殖子入侵肝细胞,减轻弓形虫速殖子对肝细胞的破坏程度,且扁桃酸对肝细胞的毒副作用极少。结论扁桃酸对弓形虫感染小鼠的肝脏有明显的保护作用。

扁桃酸对小鼠实验感染弓形虫的疗效

用扁桃酸对急性弓形虫感染小鼠进行实验治疗，动态观察小鼠感染弓形虫后腹水中弓形虫数量的变化、光镜结构及超微结构的改变。在小鼠感染弓形虫２４ ｈ 、７２ ｈ 将小鼠解剖及小鼠发病死亡后取小鼠腹水，分别计数试验组和对照组各时间腹水中弓形虫数，并将腹水涂片做Ｇｉｅｍｓａ 染色，光镜下观察虫体结构变化及用腹水制作电镜切片。结果显示，试验组小鼠３ 个不同时间腹水中弓形虫数与对照组相比均明显减少（ Ｐ＜ ０．０１） ；光镜观察可见试验组小鼠腹水中弓形虫形态异常，虫体肿胀，胞膜破裂，胞质减少，胞内出现空泡，胞核染色质疏松、聚集成块，核内出现空泡；电镜观察可见虫体超微结构受到不同程度的破坏。

弓形虫病大鼠T淋巴细胞和脾微量元素的测定

目的 观察感染弓形虫大鼠外周血T淋巴细胞及其亚型以及脾组织中 5种微量元素 (Fe2 + 、Cu2 + 、Zn2 + 、Ca2 + 、Mg2 + )含量的变化。方法 2 0只大鼠随机分为实验组和对照组。实验组每鼠经腹腔注入 2ml含 1.5× 10 6弓形虫速殖子的生理盐水悬液 ,对照组每鼠腹腔注射 2ml生理盐水。 6 4d后将 2组大鼠处死 ,取外周血及脾组织。用细胞内α 醋酸萘酯酶标记T淋巴细胞的方法观察弓形虫病大鼠外周血T淋巴细胞 (TL)及其亚型辅助性T淋巴细胞 (Th)和抑制性T淋巴细胞 (Ts)的变化 ,同时用原子吸收分光光度仪测定其微量元素的变化。结果 实验组外周血TL和Th均低于正常对照组 (P <0 .0 1、P <0 .0 1) ,两组间Th/Ts比值差异显著 (P <0 .0 1) ;实验组脾Fe2 + 、Cu2 + 含量明显减少 (P <0 .0 1,P <0 .0 1) ,而Mg2 + 含量明显增加 (P <0 .0 1)。结论 弓形虫感染能引起大鼠外周血TL。

环介导等温扩增技术在弓形虫感染小鼠腹腔液检测中的应用

目的环介导等温扩增(LAMP)检测弓形虫感染小鼠腹腔液的反应条件及反应体系的优化与筛选。方法建立弓形虫感染小鼠模型,酚氯仿法抽提小鼠腹腔液DNA作为反应模板,在弓形虫大小为529 bp的高度重复序列中选择一段靶序列设计内外引物,建立LAMP反应并对反应体系及条件中Mg^(2+)、甜菜碱及反应温度条件进行优化。结果所建立的LAMP反应以Mg^(2+)浓度和反应温度影响较为明显,而甜菜碱浓度变化的影响不大,优化后的LAMP反应体系能够特异性扩增弓形虫感染小鼠的腹水微量DNA,且对日本血吸虫、肝吸虫及盾盘吸虫的DNA的扩增显示为阴性。结论以弓形虫529 bp建立并优化后的LAMP技术可以检测到弓形虫微量DNA,并且具有较好的特异性,可对人体弓形虫轻度感染诊断技术的建立提供一定的科学依据。