弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建及其在BHK细胞中的表达

目的构建弓形虫微线体蛋白(MIC3)的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白的功能奠定基础。方法 PCR法扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3.0,并转入DH5α宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增法对重组质粒进行鉴定;应用HifectinⅡ真核细胞转染试剂将弓形虫PCDNA-MIC3真核表达质粒转染幼地鼠肾细胞(BHK),表达产物用SDS-PAGE进一步确认,ELISA法检测表达蛋白的免疫原性。结果重组质粒PCDNA-MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1 120 bp大小相同的片段,PCDNA-MIC3能在BHK细胞中高效表达,表达产物能被弓形虫特异性血清所识别。结论成功构建了弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA-MIC3。

弓形虫重组MIC3蛋白间接ELISA检测方法的建立

为检测弓形虫特异性抗体,以纯化的重组MIC3蛋白作为包被抗原,用羊抗猪IgG-HRP作为酶标二抗,分别对抗原浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度以及作用时间等进行了优化,初步建立了检测弓形虫特异性抗体的间接ELISA方法。结果显示,该方法检测猪球虫、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌等阳性血清均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。组内和组间重复性试验的变异系数均小于8%,表明该方法具有较好的重复性。应用所建立的ELISA方法和商品化试剂盒A(IHA)、B(ELISA)同时检测从南京某猪场采集的猪血清样品166份,符合率分别可达94.58%和95.78%。该方法为我国进行弓形虫病的诊断与流行病学调查提供了一种技术手段,并为试剂盒的研制与开发奠定了前期工作基础。

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建弓形虫微线体蛋白MIC3的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白功能奠定基础。方法 PCR扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3.0,并转入DH5α宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增方法对重组质粒进行鉴定。结果重组质粒PCDNA-MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1120bp大小相同的片段。结论成功构建弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA-MIC3.

抗弓形虫MIC3单抗的制备及其在速殖子免疫荧光观察中的应用

为开展弓形虫速殖子阶段蛋白表达和定位的相关研究,利用弓形虫重组微线体蛋白3(MIC3)抗原研制单克隆抗体,筛选出适合在虫体内用免疫荧光观察该蛋白的单抗分泌株,建立了弓形虫间接免疫荧光观察方法。结果显示,经4轮亚克隆后得到3株稳定分泌抗MIC3单抗的分泌株:4G1、1G12和5D7;经测定,3株MIC3单抗4G1、1G12和5D7的亚型分别为IgG1、IgG2b、IgG2b,效价分别为1∶3 200、1∶12 800、1∶1 600。筛选得到的2株MIC3单抗(4G1和1G12)可用于间接免疫荧光检测MIC3蛋白在虫体中的分布。通过弓形虫阳性感染猪血液样品推片的免疫荧光试验,验证了这3株单抗具有特异性。结果表明,研制的MIC3单抗和虫体荧光观察体系可用于速殖子MIC3蛋白在虫体表达定位和其他研究,也可作为其他速殖子抗原荧光观察的比较对象。

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫微线体蛋白MIC3基因。方法 从弓形虫RH株分离总的RNA,反转成cDNA.根据MIC3基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫cDNA中扩增MIC3基因片段,插入pGEM-T载体,并转化大肠杆菌Top10,经PCR、双酶切、测序验证后,将MIC3基因片段定向亚克隆到载体pET-28a中构建原核表达重组质粒pET-28a-MIC3,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果 从弓形虫RH株cDNA中扩增出792bp大小的MIC3基因片段并诱导表达27 300 Mr的重组MIC3蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pET-28a-MIC3重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究莫定了基础。