刚地弓形虫RH株速殖子在HeLa细胞系体外培养的实验观察

目的建立稳定高效的刚地弓形虫RH株速殖子(以下简称弓形虫速殖子)体外培养模型。方法①将HeLa细胞(1×104个)接种置于细胞培养皿内底部的盖玻片,12h后将纯化的弓形虫速殖子接种于细胞培养皿(1×104个/皿),继续培养0.5～96h,观察弓形虫速殖子在HeLa细胞内增殖情况;②将纯化的弓形虫速殖子接种于HeLa细胞后分为2组,一组于37℃分别培养24～120h后,移入25℃培养120h;另组于37℃培养48h后,移入25℃分别培养72～168h,观察不同温度和时间对弓形虫速殖子产率和活虫率的影响;③当培养的HeLa细胞80%发生细胞融合时更换速殖子培养液,同上法12h后接种纯化的弓形虫速殖子进行培养,当80%HeLa细胞被感染增殖的弓形虫速殖子涨破时,收集、计数弓形虫速殖子,并用其感染(3×106个/瓶)新的HeLa细胞,观察其连续传代情况;④每隔5代取弓形虫速殖子,腹腔接种昆明小鼠(3×106个/只),观察小鼠存活时间、评价该体外培养条件对弓形虫速殖子毒力的影响。结果接种弓形虫速殖子96h后HeLa细胞均被感染及涨破,培养弓形虫速殖子30代(3～4d为1代)增殖稳定,每代获得弓形虫速殖子1×107～5×107个,增殖5～20倍。各代弓形虫速殖子对昆明小鼠的平均致死时间为5.80～6.40d,毒力未见减弱(P>0.05)。HeLa细胞接种弓形虫速殖子,于37℃培养72h后,移至25℃培养120h,其产率高达40倍以上,活虫率为90%以上,仅残留极少量Hela细胞。结论刚地弓形虫RH株速殖子可在HeLa细胞中增殖并长期稳定传代。

RH株弓形虫速殖子体外入侵大鼠肠上皮细胞与增殖的动态观察

目的动态观察弓形虫RH株速殖子(简称速殖子)体外入侵大鼠肠上皮细胞(IEC-6细胞)及其增殖过程。方法取24孔培养板,设实验组及对照组各3孔,每孔放置经预处理的盖玻片。将常规传代培养的IEC-6细胞接种于各培养孔,于37℃5%CO2培养箱培养24h,吸弃培养液,实验组每孔加入1ml速殖子悬液(含1×106个速殖子),对照组每孔加入1ml无抗生素培养液,共培养。用倒置显微镜连续观察速殖子粘附、入侵IEC-6细胞及其增殖过程,并分别于共培养5～30min、1～48h后取出盖玻片,经吉氏-瑞氏染色后光镜观察其入侵和增殖情况,计算入侵率。结果共培养5min,速殖子即可入侵IEC-6细胞,随着共培养时间的延长入侵的速殖子逐渐增多,1h为1～5个,入侵率为(55.0±6.6)%。2h入侵率高达(81.8±10.2)%,有假包囊形成,速殖子可入侵细胞核并在核内增殖。4h入侵率降为(80.8±9.2)%,假包囊破裂释出成簇排列的速殖子。6h入侵率为(75.1±8.2)%,成簇排列的速殖子显著增多。12h成簇排列的速殖子减少,多数速殖子游离细胞外,完整的IEC-6细胞明显减少。24h只见部分IEC-6细胞和假包囊存在,有大量游离的速殖子。48h见大量游离速殖子,未见贴壁细胞。结论体外培养的弓形虫速殖子可迅速入侵IEC-6细胞,并可在细胞质及细胞核内增殖。增殖周期为6～12h。

弓形虫RH株体外培养及速殖子与缓殖子相互转化体系的建立

目的建立弓形虫RH株体外培养及速殖子与缓殖子相互转化体系。方法纯化弓形虫RH株速殖子,接种于NIH3T3细胞单层,进行体外培养。接种4h后,换用pH8.1的碱性培养基进行速殖子向缓殖子的诱导转化培养,RT-PCR检测缓殖子蛋白1(BAG1)基因的表达。将诱导的缓殖子重新用pH7.2的培养基在常规环境下培养,诱导缓殖子向速殖子转化。为探索温度对速殖子向缓殖子转化的影响,将接种RH株速殖子的NIH3T3细胞分别放在37℃、39℃、41℃、43℃中诱导转化培养,RT-RCR检测BAG1基因的表达。结果弓形虫RH株能在NIH3T3细胞单层中生长增殖,更换高pH值碱性培养环境后,能诱导弓形虫速殖子转化为缓殖子,RT-PCR检测出缓殖子期特异蛋白BAG1基因的表达,并且随着诱导时间的延长,BAG1基因mRNA的转录水平逐渐提高,表明有更多的速殖子转化为缓殖子。恢复pH7.2的常规培养条件,碱性诱导的缓殖子能转化为速殖子。在41℃诱导条件下,能诱导RH株速殖子转化为缓殖子。结论成功构建弓形虫体外培养及速殖子与缓殖子相互转化体系,为转化机制的研究奠定基础。

刚地弓形虫细胞培养的研究Ⅱ．RH株速殖子细胞培养上清对成囊株速殖子侵入细胞的影响

本文以ＲＨ株细胞培养上清（ＳＲＣ）替代ＰＬＡ２加入培养系统，对三株成囊株４次培养及与含ＰＬＡ２对照培养的观察表明，含ＳＲＣ的培养系统较常规培养检出时间提前，阳性率提高，在本文条件下与含ＰＬＡ２４０Ｕ者效果相当，提示ＳＲＣ可作为ｐＬＡ２的廉价实用的替代物用于弓形虫病的病原检测。

刚地弓形虫RH株对小鼠胎盘滋养细胞凋亡的影响

目的通过研究刚地弓形虫强毒株RH株对体外培养的孕期小鼠胎盘滋养层细胞凋亡的影响,初步探讨不同毒力虫株引起病理妊娠的机制。方法将小鼠胎盘滋养层细胞分别接种于不同细胞培养瓶,对照组加入DMEM培养基孵育,实验组加入相同体积不同数量(2×106/ml、4×106/ml、8×106/ml)弓形虫速殖子培养2、4、8h,Annexin-V-FITC/PI染色细胞后上流式细胞仪检测各个时间点细胞凋亡率变化;荧光显微镜观察细胞形态改变情况;Western blot分析凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达或活性。结果流式细胞仪检测弓形虫感染后的滋养层细胞凋亡率较对照组有下降趋势(P<0.05),呈量效依赖性,弓形虫数量8×106/ml实验组8h凋亡率最低,为(15.81±0.19)%;荧光显微镜观察到8h不同数量实验组滋养细胞凋亡形态改变情况,各组均有典型的早期凋亡细胞:细胞膜着绿色,细胞核拒染。随着弓形虫感染数量增加,凋亡细胞数目有所减少。Western blot检测刚地弓形虫RH株作用于滋养层细胞8h后实验组的Bax、Bcl-2蛋白表达较对照组分别有明显的降低与升高(P<0.05)。结论刚地弓形虫RH株可抵抗体外培养的孕期小鼠滋养细胞正常凋亡,其机制可能与滋养细胞Bax表达下调和Bcl-2表达上调有关。

刚地弓形虫RH株感染对小鼠胎盘滋养层细胞周期的影响

目的研究刚地弓形虫RH株对体外培养的孕期小鼠胎盘滋养层细胞周期的影响及相关机制。方法制备小鼠胎盘滋养层细胞并分别接种于不同细胞培养皿,对照组加入DMEM高糖培养基孵育,实验组加入相同体积不同数量(2×104/mL、4×104/mL、8×104/mL)弓形虫速殖子培养6h、12h、24h;以MTT法检测滋养细胞增殖率;流式细胞仪检测细胞周期;Western印迹法检测细胞周期相关蛋白cyclinA、cdk2表达或活性。结果 MTT法检测结果显示刚地弓形虫RH株抑制滋养层细胞增殖,且呈时间剂量依赖性;流式细胞仪检测24h感染组细胞周期在S期产生阻滞,8×104/mL数量组S期细胞比例高达68.73%±1.76%;Western印迹方法分析感染弓形虫组滋养层细胞的cyclinA、cdk2蛋白表达量较对照组明显下降(P<0.05)。结论刚地弓形虫RH株能够抑制小鼠胎盘滋养层细胞增殖并通过调节cyclinA、cdk2等蛋白表达或活性改变引起细胞S期阻滞。

弓形虫RH株速殖子在体外形成包囊的观察

弓形虫ＲＨ株速殖子在ＨｅＬａ细胞内生长第７天出现包囊样结构，透射电子显微镜观察培养１４ｄ的包囊显示高致密度均匀一致的囊壁。

人包皮成纤维细胞和人子宫颈癌细胞体外培养弓形虫速殖子

目的比较弓形虫RH株速殖子在人包皮成纤维细胞(humanforeskinfibroblast,HFF)和人子宫颈癌(HeLa)细胞的感染和细胞内增殖情况。方法分别于含一盖玻片的细胞培养皿(35mm)内培养HFF细胞和HeLa细胞。待形成单细胞层后各加入经3μm滤膜纯化的弓形虫RH株速殖子共培养,分别于0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、72和96h取出盖玻片,经吉氏染色镜下观察速殖子在两种细胞内的增殖情况。结果与HFF细胞共培养4h后,速殖子即可侵入HFF细胞,1个细胞内可见数十个速殖子;24h可见明显的假包囊,72h细胞被胀破。而与HeLa细胞共培养8h后速殖子才侵入细胞,每个细胞内可见3～5个速殖子,48h形成假包囊,96h大部分细胞被胀破。结论弓形虫RH株速殖子可在HFF细胞和HeLa细胞内增殖,在HFF细胞内的增殖速度快于HeLa细胞。

蒿甲醚体外抗弓形虫作用的实验研究

目的 :了解蒿甲醚体外抗弓形虫速殖子的作用效果。方法 :采用大鼠肾细胞培养技术 ,观察蒿甲醚 (浓度 0 .0 1- 10 0 μg/ ml)对虫体侵入细胞及在细胞内增殖的影响 ,选乙酰螺旋霉素作对照。结果 :蒿甲醚抗弓形虫作用的最低有效浓度为 0 .1μg/ ml。当其浓度为 4 μg/ ml时 ,作用速殖子 4 8h后 ,光镜下多数虫体变形 ,胞质内出现空泡、颗粒。乙酰螺旋霉素的作用不及相同浓度的蒿甲醚。结论 :蒿甲醚在体外能抑制弓形虫速殖子的侵袭和繁殖力 ,且具有杀虫效果。

刚地弓形虫细胞培养上清对人结肠癌细胞sw480增殖与凋亡的影响

目的观察刚地弓形虫RH株速殖子与人结肠癌sw480细胞系共培养上清对人结肠癌sw480细胞增殖的影响和诱导其凋亡与坏死的情况。方法取对数生长期的人结肠癌sw480细胞(1×106),建立弓形虫RH株速殖子数目分别为2×106、4×106、8×106、16×106的共培养模型,观察弓形虫速殖子在sw480细胞中的寄生,提取共同孵育72h后的培养上清,以新鲜培养基稀释为半量,体外作用人结肠癌sw480细胞12h、24h、48h、72h,CKK-8法检测吸光度(A450值)并计算抑制率;Annexin-v-FITC/PI染色细胞后上流式细胞仪检测细胞凋亡与坏死率;琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡DNA条带;透射电镜和荧光显微镜观察细胞形态学改变。结果弓形虫RH株速殖子可在人结肠癌sw480细胞内寄生和增殖。CKK-8法检测结果显示上述共培养上清对sw480细胞增殖抑制率随上清作用时间延长均明显增大,48h最大抑制率达44.55%。流式细胞仪检测显示实验组sw480细胞早期凋亡率和晚期凋亡与坏死率随上清作用时间延长均明显增加,48h早期凋亡率达最高值(11.54%),48h以后早期凋亡率下降,晚期凋亡和坏死率显著上升,72h总死亡率可达46.11%,细胞杀伤效果明显;琼脂糖凝胶电泳显示典型的DNA云梯状条带;荧光显微镜和透射电镜观察到细胞凋亡和坏死典型形态。结论弓形虫RH株速殖子与人结肠癌sw480细胞共培养上清对体外培养的sw480细胞增殖有明显的抑制作用,并可诱导sw480细胞凋亡与坏死。

应用细胞培养方法分离猪源弓形虫虫株

为获得猪源弓形虫野生虫株,对细胞培养过程中的培养基种类、血清用量及培养佐剂等条件进行优化,选择最佳分离条件。对临床血清学检测呈阳性猪场的19份血液样品进行弓形虫虫株的培养检测,共获得野生虫株10株。运用PCR方法进行初步鉴定,证实分离虫株为弓形虫野生虫株。结果表明,细胞培养方法是一种分离弓形虫虫株较为理想的方法。

弓形虫感染体外培养细胞的电镜观察

用电镜观察了弓形虫在人脑恶性胶质瘤细胞（ＨＧＣ）、人胚肺细胞（ＨＥＰＣ）、人Ｋ５６２细胞和猴肾细胞（Ｖ－１１６）中感染和寄生状况及受感染细胞的病理变化。结果显示，ＨＧＣ、ＨＥＰＣ对弓形虫的感染率和受感细胞含虫数量均高于Ｖ－１１６。提示中枢神经系统的细胞和胚胎细胞对弓形虫的易感性较强。在一些超微结构损伤较严重的Ｖ－１１６细胞中，见弓形虫攻击溶解细胞核膜并进入核内寄生，可能细胞浆结构的损伤和环境的改变是弓形虫进入细胞核的原因之一。此外，上述各种细胞感染弓形虫后均可见线粒体空泡化和髓样变、细胞肿胀、核溶解和细胞崩解等病理变化。

Vero细胞无血清培养制备弓形虫排泄-分泌抗原适宜条件的筛选

目的筛选Vero细胞无血清培养制备弓形虫排泄-分泌抗原(ESA)的适宜条件。方法采用拉丁方析因设计。第一部分:在血清浓度为0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的培养基中,共培养Vero细胞与弓形虫速殖子,分别于培养3、6、12、24h时,改为无血清培养基,继续培养至第7天,收集培养上清液,制备ESA,并检测蛋白含量。第二部分:在含1.0%血清培养基中共培养Vero细胞与弓形虫速殖子,分别于培养12、24、48、72h时,改为无血清培养基,继续培养至第7、9、11、13天,收集培养上清液,制备ESA,并检测蛋白含量。结果Vero细胞与弓形虫速殖子在1.0%血清浓度培养基中培养12或24h时,无血清培养基继续培养7d,制备的ESA蛋白含量显著高于其他血清浓度(0.5%、2.0%、4.0%)及含血清培养时间(3、6h)。Vero细胞与弓形虫速殖子在含1.0%血清培养基中共培养12、24h,无血清培养基继续培养至第13天,制备的ESA蛋白含量显著高于其他培养时间(48、72h)和无血清培养基继续培养时间(7、9、11d)。结论培养基的血清浓度以及含血清和无血清培养时间是影响体外制备ESA的重要因素。Vero细胞与弓形虫速殖子在1.0%血清浓度培养基中培养12h,无血清培养基继续培养13d,为制备ESA的适宜条件。

弓形虫在培养细胞及小鼠体内繁殖的电镜观察

本实验用电镜观察了弓形虫ＮＴ株在猴肾细胞、人胚肺细胞、恶性胶质瘤细胞及小鼠腹水、肝脏和子宫等组织中的生长繁殖形式，并计数各种繁殖方式出现的百分率，结果显示，大多数弓形虫以内芽殖方式繁殖，少部为等分裂繁殖，裂殖繁殖最少见。裂殖繁殖时弓形虫体内的子细胞生长发育常不是同步的。成熟的子细胞以出芽的方式脱离母体，并围绕母体形成玫瑰花状或蜂窝状等群落。三种繁殖方式在各种宿主细胞和组织中出现的频率各不相同，小鼠肝和子宫组织中弓形虫等分裂繁殖较在其它细胞中少见，裂殖繁殖仅见于培养细胞和小鼠腹水中。提示宿主细胞种类的不同可能影响弓形虫的繁殖方式。

弓形虫包囊超微结构的观察

目的 :观察弓形虫包囊的超微结构 ,鉴定体外细胞培养所形成的包囊。方法:体外用HeLa细胞作载体培养PP株弓形虫形成包囊;体内用感染Fukaya株弓形虫的小鼠脑包囊,分别做电镜标本并观察。结果 :两者都观察到包囊的特征性超微结构且结果相类似。结论:弓形虫在体外一定培养条件下可以形成包囊。

刚地弓形虫细胞培养的研究Ⅰ．磷脂酶A2对成囊株速殖子侵入细胞的影响

已知多种酶和细胞因子对弓形虫侵入细胞有促进或抑制作用。本研究旨在探讨利用对弓形虫侵入细胞有促进作用的因子提高以细胞培养作病原诊断的敏感性。以激素弱化的小鼠接种成囊株包囊获得速殖子，以单核细胞ＴＨＰ－１细胞系的培养系统定量接种速殖子并加入源自蛇毒的磷脂酶Ａ２（ＰＬＡ２），以免疫荧光法和流式细胞仪检测细胞感染率。结果表明ＰＬＡ２对弱毒株速殖子侵入细胞有明显促进作用，在４株成囊株培养不同时间的检测，其感染细胞比率均比对照有显著提高。

弓形虫两种保种方法的试验

目的寻求一个简便、适宜的弓形虫保种方法。方法采用不同温度的冷冻保存法和细胞培养保存法对弓形虫保存进行了试验研究,为深入研究弓形虫提供保证。结果弓形虫在液氮(-196℃)、-70℃能长期保存,4℃能保存14 d。通过细胞培养能获得大量的弓形虫滋养体,对培养细胞的选择性不强。结论两种保种方法保存后弓形虫毒力不变。

刚地弓形虫以成纤维细胞和单核细胞培养检测的比较

本文观察了刚地弓形虫ＲＨ株和Ｐｒｕｇｎｉａｕｄ株速殖子在成纤维细胞ＭＲＣ５和单核细胞ＴＨＰ－１培养以ＩＦＡ检测的结果，表明以两种细胞系培养在较大接种量时（５００速殖子／ｍｌ）其检测敏感性相当，而在少量接种（５０／ｍｌ和５／ｍｌ速殖子）则单核细胞培养较成纤维细胞敏感，检出率分别为６０．０％和２５．０％，前者尚有６例ＩＦＡ阴性者以流式细胞仪（ＦＣＭ）检获阳性，因而ＴＰＨ－１组总阳性率为７５．０％。提示以细胞培养进行弓形虫病原分离时ＴＨＰ－１是较适宜的宿主细胞。

刚地弓形虫细胞培养的研究Ⅲ．不同毒力株速殖子培养检出时间的差异

本文观察了弓形虫ＲＨ株、Ｐｒｕｇｎｉａｕｄ株和８株源自羊水等标本的野生株速殖子，在以单核细胞ＴＨｐ－１作为受染细胞的培养系统中不同接种量其检出时间的差异。结果表明，ＲＨ株和Ｐｒｕｇｎｉ－ａｕｄ株各不同接种量最早可在１～４ｄ内获阳性结果，而野生株仅１株可检测到每管（２ｍｌ）１０速殖子的接种量（第１４ｄ），１００速殖子接种量６／８株在第１４ｄ检获阳性。提示在以细胞培养进行弓形虫病原检测时适当延长培养检测时间可提高阳性率。

弓形虫感染培养细胞核的超微结构研究

为弄清弓形虫侵袭、损害宿主细胞核的过程及机制,采用电镜观察弓形虫侵入体外培养的猴肾细胞、恶性胶质瘤细胞和人胚肺细胞胞核的过程,及其在核内的寄生状况。结果显示,弓形虫攻击细胞核时,先以顶端与核膜接触,使该处核膜溶解,然后进入核内。核内寄生的虫周围有一低电子密度区,但没有膜性结构包绕。核内有弓形虫寄生的细胞数较少,但这些细胞的胞质结构常破坏严重,这些结构的损伤和胞质内环境的变化可能是弓形虫进入核内寄生的原因之一。