地高辛素标记弓形虫DNA探针的制备及在产前诊断的应用

本文建立了地高辛素标记的弓形虫ＤＮＡ探针并在２３例产前咨询孕妇中作产前诊断。通过聚合酶链反应扩增弓形虫ＲＨ株ＴＧＲ４核酸片段，扩增产物７７８ｂｐ片段经寡核苷酸层析柱纯化后，用地高辛素标记作为探针，与待检材料斑点杂交。结果显示该探针与待杂交的弓形虫ＲＨ、ＺＳ１、ＺＳ２、ＳＨ１株ＤＮＡ杂交；而与恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、杜氏利什曼原虫、大肠杆菌、巨细胞病毒ＤＮＡ无杂交。并能在待杂交液中检测出相当于１ｐｇ水平ＤＮＡ，表明该探针具有高度的特异性及敏感性。检测２３例孕期１０—１４周孕妇中，阳性３例，其中一孕妇外周血、绒毛组织及羊水均呈阳性。另一例的外周血及绒毛组织呈阳性。该探针稳定、敏感、操作简单，具有推广意义。

弓形虫人源、畜源分离株的生化特性研究

本文采用弓形虫特异ＤＮＡ探针杂交技术，聚丙烯酰胺电泳，免疫印迹试验，色质谱分析对弓形虫人源分离的ＳＨ、Ｚｓ２株，猪源分离的ＣＮ，ＰＰ株，兔源ＲＴ株等１１个分离株在核酸、蛋白质、脂肪酸方面与国际标准人株ＲＨ株进行分子生化特性的比较与分析，实验结果表明用３２Ｐ标记弓形虫ＤＮＡ探针（１．１Ｋｂ）能与各虫株ＤＮＡ杂交，在２．０Ｋｂ位点上显示出明显的杂交带；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳蛋白质分子量范围在１－１２０ＫＤ间，以１４、１８、２２、３０、３５、３７、４１、４３、５２、７６ＫＤ为各虫株共有的条带，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，各虫株在３０、５２、７６ＫＤ均能被抗弓形虫ＩｇＧ识别；有机质谱仪检测脂肪酸组分中各虫株均有６种主要脂肪酸组成（ｃ１４一Ｃ１８）分别为肉豆蔻酸、棕榈油酸、软脂酸、硬脂酸、油酸和亚油酸，其中油酸和软脂酸占总脂肪酸含量的７０％，各虫株相对含量有所差异。实验结果为弓形虫分离株的生化特性和鉴定工作提供了科学理论依据。

聚合酶链反应掺入法制备标记探针检测弓形虫感染的研究

本文采用聚合酶链反应（PCR）技术，以Dig一i1—dUTP代替部分dTTP直接制备标记弓形虫特异性rDNA基因片段作为探针，用于检测弓形虫感染。该探针和弓形虫核酸抽提物杂交阳性，而与恶性疟原虫、间日疟原虫、杜氏利什曼原虫以及正常人血样核酸抽提物杂交阴性，该探针至少可检测出相当于156虫数的水平，结果表明：PCR掺入法是一种简便、有效的制备标记探针的方法，以该法制备的弓形虫rDNA基因探针适用于弓形虫感染的诊断及流行病学调查研究。

聚合酶链反应技术检测弓形虫核酸的研究

本文通过克隆的ＲＨ株弓形虫核酸ＴＧＲ４片段，设计并合成了一对长度为２０ｂｐ的寡核苷酸引物，扩增靶序列长度为７７８ｂｐ，建立了聚合酶链反应技术检测弓形虫核酸的特异敏感方法。检测７株弓形虫株及临床疑似弓形虫病患者样本，均出现特异扩增带，而其它８种病原体以及正常人及动物的ＤＮＡ均未见特异扩增带。扩增产物用地高辛素标记作探针，与以上出现特异扩增带的ＤＮＡ模板能斑点杂交，而与无扩增带的其余模板ＤＮＡ无斑点杂交。结果显示，该引物具有高度的保守性及特异性。在含１０５个人白细胞中，可检测到２个弓形虫ＤＮＡ或１ｐｇＤＮＡ。并通过人工感染弓形虫鼠血样品的检测表明，所建立的聚合酶链反应体系具有高度的敏感性，能早期检出弓形虫感染样品，在弓形虫病的临床诊断中具有重要的应用价值。