梅毒螺旋体重组蛋白Tp0608的表达与鉴定

目的表达梅毒螺旋体(Tp)重组蛋白Tp0608(rTp0608)并鉴定其抗原性,为深入探讨其在梅毒血清学诊断中的价值奠定基础。方法 PCR扩增Tp0608全长基因,构建原核表达重组体pET-28a(+)/Tp0608,转化宿主菌诱导表达rTp0608,Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白,SDS-PAGE分析蛋白表达形式与纯度,Western blot鉴定rTp0608的抗原性。结果原核表达重组体pET-28a(+)/Tp0608在宿主菌内经诱导表达了分子量大约为38 kDa的重组蛋白,以包涵体表达形式为主,纯化蛋白的纯度>95%;Western blot结果显示纯化蛋白能被梅毒患者混合血清特异性识别。结论 PET-28a(+)表达载体高效表达了rTp0608,该重组抗原有良好的抗原性。

重组蛋白抗原Tp0608对梅毒诊断的血清学评价

目的探讨重组蛋白抗原Tp0608对梅毒诊断的血清学评价价值。方法收集各期梅毒患者406例以及可能有交叉反应的患者90例,建立了一个重组蛋白抗原Tp0608,用酶联免疫吸附试验(ELISA)对梅毒各期患者及可能有交叉反应的患者进行了检测,并与常规的快速血浆反应素试验(RPR)+梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)进行对比。结果对各期梅毒患者,Tp0608重组蛋白筛查的灵敏度为95.3%,RPR+TPPA筛查灵敏度为93.1%。对可能有交叉反应的患者,Tp0608重组蛋白筛查的特异度为99.1%,ROC曲线的AUC为0.99;RPR+TPPA筛查的特异度为97.2%,ROC曲线的AUC为0.96。Tp0608重组蛋白对梅毒筛查的灵敏度、特异度均高于常规的RPR+TPPA检测方法,特别是对先天性梅毒、一期梅毒的检测优于常规方法。结论 Tp0608重组蛋白是非常有前景的梅毒筛查的诊断性抗原,但其在细胞内的位置和保护性反应还未确定,还有待进一步研究和验证。

梅毒螺旋体Tp0453重组蛋白的表达纯化及免疫活性研究

目的表达梅毒螺旋体膜蛋白Tp0453(28-288 aa),纯化表达产物并进行免疫活性分析,为探索Tp0453重组蛋白在梅毒血清学诊断中的应用提供实验依据。方法通过生物信息学分析,挑选Tp0453抗原的优势表位,进行诱导表达;以W estern-b lot和间接ELISA法检测重组蛋白的免疫反应性;用重组蛋白免疫新西兰家兔,评价其免疫原性。结果纯化后获得了相对分子量约为32×103的融合蛋白。W estern-b lot检测其能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应;同时以重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA法,检测梅毒诊断试剂参考血清,其阴阳性符合率均为100%。用纯化的Tp0453重组蛋白免疫新西兰家兔,能诱导其产生特异性免疫应答,ELISA法测定免疫血清中特异性抗体滴度在1∶1280以上。结论基因重组表达的Tp0453重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,为进一步研究其在梅毒血清学诊断中的应用和其生物学功能奠定了基础。

重组梅毒螺旋体蛋白Tp47通过诱导uPA增加血管内皮细胞通透性

目的探讨重组梅毒螺旋体蛋白Tp47(rTpp47)对单核-巨噬细胞系THP-1合成尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的调控及其对人脐静脉/血管内皮细胞(HUVECs)通透性的影响。方法用rTpp47刺激THP-1细胞24 h后,分别收集细胞培养上清和THP-1细胞,用ELISA和Western blot检测THP-1细胞表达的uPA含量;用THP-1细胞培养上清刺激人单层血管内皮细胞后,使用FITC-葡聚糖评价单层内皮细胞通透性的变化,用Western blot检测uPA对HUVECs细胞紧密连接蛋白claudin-5表达的影响以及PKC信号通路是否参与rTpp47诱导的THP-1细胞表达uPA。结果重组蛋白rTpp47刺激THP-1细胞合成和分泌的uPA显著高于对照组(P<0.05,P<0.001);用rTpp47与THP-1细胞共培养24 h后收集的细胞培养上清刺激单层血管内皮细胞12和24 h,实验组血管内皮细胞相对通透性显著高于对照组(P<0.05,P<0.0001);uPA活性抑制剂阿米洛利(amiloride)抑制了rTpp47刺激THP-1细胞分泌uPA(P<0.0001),改善了rTpp47对HUVECs的claudin-5蛋白表达的抑制作用(P<0.05),抑制了rTpp47诱导的THP-1细胞表达蛋白激酶C(PKC)的磷酸化(P<0.05)。结论重组蛋白rTpp47可能通过激活PKC信号通路刺激THP-1细胞合成和分泌的uPA,uPA作用于血管内皮细胞,可能导致血管内皮细胞通透性升高。

梅毒密螺旋体Tp47重组蛋白的表达及其应用

目的 在大肠埃希菌中表达梅毒密螺旋体 (Treponemapallidum ,Tp)Tp47重组蛋白 ,用其建立诊断梅毒的酶联免疫法 (enzymeimmunoassay ,EIA)。 方法 应用聚合酶链反应法 (PCR)从Tp全基因组中扩增目的片段Tp47,并将其克隆到表达载体 pET - 3 0a中 ,构建重组质粒pET - 3 0a -Tp47。在大肠埃希菌中表达重组蛋白Tp47,亲和层析柱纯化 ,建立EIA法 ,检测血清中抗 -Tp抗体。 结果 获得了Tp47基因重组蛋白的高效表达 ,该重组蛋白存在于细菌上清中 ,占全菌体蛋白 12 %左右 ,分子量约 3 9kDa。蛋白印迹法 (westernblot,WB)显示 ,Tp47重组蛋白具有良好的抗原性。用Tp47重组蛋白建立EIA法 ,检测 11份梅毒血凝试验阳性和 2 8份阴性血清 ,灵敏度为 10 0 % (11/ 11) ,特异性为 96 4% (2 7/ 2 8)。

梅毒螺旋体Tp0453-Tp0257重组融合蛋白的表达及作为梅毒诊断候选抗原的初步研究

目的本研究旨在探讨梅毒螺旋体Tp0453-Tp0257重组融合蛋白检测梅毒感染的可能性。方法用基因合成的方法构建重组p ET-28a-Tp0453-Tp0257质粒,重组融合蛋白的鉴定用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,重组融合蛋白作为抗原用于ELISA实验,该蛋白的灵敏度用来自一期、二期、三期和隐性梅毒患者的血清(90例)进行评估,其特异性用正常体检者的血清(120例)评估。结果 Western Blot分析证实了Tp0453-Tp0257重组融合蛋白能与梅毒阳性血清反应。该蛋白对梅毒诊断的总灵敏度为97.8%、总特异性为100.0%。结论本实验Tp0453-Tp0257重组融合蛋白作为新的梅毒特异诊断的候选抗原,取得较好的实验效果,有望进入临床推广使用。

梅毒螺旋体黏附素蛋白TP0136不同亚型重组蛋白在神经梅毒患者血清诊断中的应用

目的探讨不同亚型梅毒螺旋体(Tp)黏附素蛋白TP0136在神经梅毒(NS)患者血液中的诊断价值。方法比较60例NS患者与120例非神经梅毒的梅毒患者(NNS)一般情况。通过分子克隆技术构建表达和纯化Nichols Seattle TP0136(NST)和Nichols Houston TP0136(NHT)重组蛋白,采用ELISA方法检查NS和NNS患者血清中NST和NHT抗体水平。结果NS和NNS患者两组之间年龄、性别、来源地、职业无统计学差异(均P>0.05),而婚姻状况、神经系统症状、血清或血浆TRUST和TPPA滴度、血清或血浆TP-IgM阳性率、脑脊液TRUST和TPPA滴度均有统计学差异(均P<0.05)。NST在NS组和NNS组血清或血浆中抗体水平无差异(t=0.15,P=0.920);NHT在NNS组血清或血浆中抗体水平高于NS患者,差异有统计学意义(t=3.68,P=0.021)。结论Tp黏附素蛋白TP0136重组蛋白NHT或可作为NS诊断的潜在血液学标志物。

肿瘤抑制因子p53蛋白在毕赤酵母中的克隆表达

TP53基因在调控细胞信号通路和抑制肿瘤细胞中发挥着重要作用.本研究利用毕赤酵母表达系统以获得大量重组p53蛋白,为此,本文将人TP53基因克隆至表达载体p PIC3.5K,电转化进入毕赤酵母GS115,通过组氨酸筛选和G418筛选,获得高拷贝稳定转化子.SDS-PAGE和Western Blot检测结果表明p53蛋白可以在毕赤酵母中表达.本研究所获酵母菌株为今后大规模生产重组p53蛋白奠定了基础.

梅毒螺旋体重组蛋白Tp0136的表达、纯化及免疫活性分析

目的 克隆并表达梅毒螺旋体Tp0136基因，对其表达产物进行纯化以及免疫活性分析。方法 全基因合成Tp0136基因，构建E.coli表达载体；诱导表达并纯化重组蛋白，用SDS-PAGE和Western印迹鉴定。用纯化的重组蛋白Tp0136免疫新西兰兔，并以重组Tp0136作为包被抗原建立间接酶联免疫吸附试验（ELISA）以鉴定其免疫原性，Western印迹检测梅毒阳性血清鉴定其免疫反应性。结果 成功构建E.coli表达载体pET28a-Tp0136，并表达和纯化出膜蛋白Tp0136，相对分子质量为50 000，纯度 〉 95%。用重组蛋白Tp0136免疫新西兰兔，能刺激其产生高滴度抗体，具有较强的免疫原性。Western印迹显示其能与梅毒阳性血清发生特异性反应，具有较好的免疫反应性。结论 成功表达具有Tp0136全基因和较强免疫活性的膜蛋白，Ｔp０１３６可能在梅毒螺旋体的免疫致病机制中起到重要作用。

梅毒螺旋体TP0993重组蛋白的表达、纯化及免疫活性分析

目的探讨梅毒螺旋体重组蛋白TP0993在梅毒血清学诊断中的应用价值。方法通过生物信息学分析，获取TP0993基因序列，构建原核载体进行诱导表达；Ni—NTA亲合层析柱纯化重组蛋白，Western印迹检测其免疫抗原性，用重组蛋白直接注射免疫新西兰家兔，评价其免疫原性。用纯化的TP0993重组蛋白包被微孔板，建立间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，检测临床梅毒患者血清和健康体检者正常血清，同时与梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）进行比较，根据重组蛋白与梅毒阴阳性血清的反应情况，评价重组抗原在梅毒血清学诊断中的应用价值。结果成功构建PET-28a（＋）-0993原核表达载体，经表达、纯化后获得相对分子质量约为34000的重组蛋白；Western印迹检测显示该重组蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应；利用纯化的TP0993重组蛋白免疫新西兰兔，能诱导新西兰兔产生特异性免疫应答。以重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA法，对TPPA法检测的480份临床血清进行检测，与TPPA法比较ELISA法的灵敏度为88．3％，特异度为85．8％，ELISA法与TPPA法符合率为86．5％。结论重组表达的TP0993蛋白具有较好的免疫活性，可作为梅毒血清学诊断的候选抗原之一。

梅毒螺旋体 Tp0844重组蛋白的表达、纯化及免疫反应性研究

目的：克隆、表达梅毒螺旋体重组蛋白 Tp0844，纯化表达产物并进行免疫反应性分析，筛选与宿主具有高反应性的 Tp 主要蛋白。方法通过生物信息学分析，获取 Tp0844基因序列，构建原核载体进行诱导表达；Ni-NTA 亲合层析柱纯化重组蛋白，Western 印迹法检测其重组蛋白与梅毒阴阳性血清的反应情况。结果成功构建 PET-30a（＋）-Tp0844原核表达重组体，经诱导表达后发现该重组体可高表达出可溶性的重组蛋白，经亲和层析纯化后获得了相对分子质量为43000的重组蛋白；以梅毒 IgG 抗体阴、阳性血清为一抗，采用 Western 印迹法检测发现，Tp0844重组蛋白与梅毒阳性血清能发生明显特异反应，而与健康阴性血清未出现反应条带。结论可溶性重组表达的 Tp0844蛋白具有较好的免疫反应性，可作为梅毒发病机制研究的候选抗原。

梅毒螺旋体Tp0751黏附蛋白的表达、纯化及免疫活性研究

目的表达梅毒螺旋体黏附蛋白Tp0751，纯化表达产物并进行免疫活性分析，为探索Tp0751重组蛋白在梅毒致病过程中的作用奠定基础。方法通过生物信息学分析，去除Tp0751信号肽序列，构建原核表达体进行诱导表达；Ni亲和层析柱纯化重组蛋白，Western blot检测其免疫反应性，用重组蛋白免疫新西兰家兔，评价其免疫原性。结果成功构建了pET-28a（＋）-0751原核表达载体，经表达、纯化后获得了相对分子质量约为26×10^3的融合蛋白；Western blot检测其能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应；利用纯化的Tp0751重组蛋白免疫新西兰家兔，能诱导家兔产生特异性免疫应答，ELISA法测定免疫血清中特异性抗体滴度在1：10 240以上。结论重组表达的Tp0751黏附蛋白具有良好的免疫活性，为进一步研究其在梅毒致病过程中的作用和生物学功能奠定了基础。

梅毒螺旋体Gpd重组蛋白的表达

随着基因工程技术的迅速发展和梅毒螺旋体（TP）全基因序列的解析，通过重组技术已制备多种重组Tp抗原，并被广泛应用于梅毒血清学检测的研究和试剂盒的开发，但对于哪一种Tp蛋白抗原亿临床各期梅毒的血清学诊断中具有更高的特异性和敏感性尚无一致观点。我们应用软件筛选分析，选取抗原性较啦的Tp外膜蛋白Gpd进行克隆表达。并以重组蛋白为包被抗原，建立间接ELISA法，评价其在悔毒血清学诊断中的应用价值。

苍白密螺旋体Tp0751黏附蛋白的表达、纯化及免疫反应性分析

目的表达苍白密螺旋体(梅毒螺旋体)黏附蛋白Tp0751,纯化表达产物并进行免疫反应性分析,为探索Tp0751重组蛋白在梅毒致病过程中的作用奠定基础。方法通过生物信息学分析,去除Tp0751信号肽序列,构建原核表达体进行诱导表达;Ni亲合层析柱纯化重组蛋白,Western-印迹检测其免疫反应性。结果成功构建了PET-28a(+)-0751原核表达载体,经表达、纯化后获得了相对分子量约为26×103的融合蛋白,其表达产物占全菌总蛋白的>30%,并且主要可溶性形式存在;Western-印迹检测其能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。结论重组表达的Tp0751黏附蛋白为可溶性蛋白,且具有良好的免疫反应性,为进一步研究其在Tp0751黏附蛋白在梅毒致病过程中的作用和其生物学功能奠定了基础。