梅毒螺旋体膜蛋白Tp92真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的 以梅毒螺旋体 (Treponemapallidum ,Tp)外膜蛋白基因Tp92为目的基因 ,构建Tp真核表达重组体pcDNA3 .1(+ ) -Tp92 ,并鉴定其在Hela细胞能否正确表达 ,为进一步开展TpDNA疫苗动物实验打下基础。 方法 应用PCR技术从TpNichols株基因组模板中扩增Tp92基因 ,定向克隆构建真核表达重组体 pcDNA3 .1(+ ) -Tp92 ,脂质体介导将 pcDNA3 .1(+ ) -Tp92转染入Hela细胞 ,以免疫酶标法和一步法RT -PCR检测pcDNA3 .1(+ ) -Tp92在Hela细胞中的表达情况。 结果 双酶切及测序鉴定证明成功构建Tp真核表达重组体pcDNA3 .1(+ ) -Tp92 ,DNA测序显示重组质粒含有 2 10 3bp的目的基因片段 ,读码框架正确 ,无碱基错配及移码突变。测序后结果经与GenBank登录的序列做blast比较 ,载体上所连目的基因片段序列与GenBank登录的Nichols株Tp92基因序列完全一致 ,同其他病原性密螺旋体菌株登陆序列比较同源度为 95 .5 %～ 10 0 % ,证实本研究所得到的基因为所需基因 ,同时也表明该基因为Tp的保守性基因。免疫酶标法结果显示该重组体在Hela细胞能有效表达目的蛋白与梅毒阳性标准血清中相应抗体反应 ;RT -PCR检测结果显示RT -PCR扩增产物与Tp92基因片段大小相符 ,确实源于重组质粒转录后的mRNA。