梅毒螺旋体TpN15-47融合基因原核表达系统的构建

目的构建梅毒螺旋体TpN15-47融合基因及其原核表达系统。方法分别克隆TpN15和TpN47基因,利用T4连接酶构建TpN15-47融合基因,常规方法构建其原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白TpN15-47表达情况。结果连接的TpN15-47基因测序分析表明,插入的基因片段为TpN15-47融合基因,与GenBank报道相同。目的重组蛋白TpN15-47表达产量约为细菌总蛋白85.79%,主要以包涵体形式存在。结论所构建的原核表达系统能高效地表达TpN15-47融合蛋白,为后期梅毒螺旋体基因疫苗和临床检测试剂盒的研制奠定了基础。

梅毒螺旋体TpN15重组抗原的克隆与表达

目的：用基因工程技术表达梅毒螺旋体TpN15重组抗原，为进一步研制梅毒螺旋体疫苗和ELISA诊断试剂盒奠定基础。方法：采用PCR技术扩增梅毒螺旋体TpN15基因，进行T-A克隆及测序，然后亚克隆到原核表达载体中，以亲和层析法纯化重组蛋白。结果：成功地构建了pET32-TpN15重组表达载体，TpN15重组蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达。结论：梅毒螺旋体TpN15基因在大肠杆菌中的成功表达为临床检测梅毒感染的新方法和梅毒螺旋体疫苗的研制奠定了基础。

免疫印迹法检测TPN15,TPN17,TPN45和TPN47抗体表达在梅毒诊断中的应用评估

目的通过对4种血清学梅毒实验方法比对,评估免疫印迹法检测TPN15,TPN17,TPN45和TPN47抗体表达在梅毒诊断中的应用。方法于2018年6月~2019年6月,收集河北燕达医院28 417例梅毒筛查样本,综合化学发光微粒子免疫(CMIA)检测结果 S/CO值、梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)结果及快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)检测结果进行分组,确认实验以梅毒螺旋体抗体免疫印迹试验(TP-WB)平行测定3组标本。相关分析采用Pearson r距离法;数据分类可视化采用主成分分析法。采用Medcalc软件进行ROC曲线统计分析,计算曲线下面积,确定CMIA法对梅毒诊断效能最大时的S/CO最佳截断点;不同诊断方法计数资料的比较采用卡方检验。结果以TP-WB结果为参照,ROC曲线分析发现,当CMIA法S/CO截断值为6.79时,敏感度为79.41%,特异度为96.05%,此时曲线下面积最大为0.911,即6.79为CMIA法的最佳诊断截断值。TPN15,TPN17,TPN45及TPN47抗体表达水平与S/CO比值均呈正相关(P<0.05),相关系数r分别为0.87,0.81,0.87及0.76。当标本中免疫印迹法检测TPN15,TPN17,TPN45和TPN47抗体均阳性且着色强度数值高反应性(50~170)时,四种检测方法阳性符合率、总符合率为100%,显示评价方法和比对方法具有高度一致性(P<0.01)。结论活动性梅毒患者TPN15,TPN17,TPN45和TPN47抗体表达均阳性且着色强度高反应性,梅毒抗体单阳梅毒特异性抗体TPN17和TPN47抗体表达减少且抗体着色强度降低,阳性率显著减少(P<0.05)。梅毒抗体结果可疑患者中TPN15,TPN17,TPN45和TPN47抗体表达明显减少,梅毒血清CMIA法筛查S/CO在6.79以下时,建议进一步采用梅毒免疫印迹检测法进行确证。

梅毒螺旋体TpN15抗原重组表达及rTpN15-ELISA血清学检测效果

目的:克隆并构建梅毒螺旋体tpN15基因原核表达系统,建立基于rTpN15的ELISA并对其用于梅毒血清学诊断的敏感性和特异性进行评价。方法:采用PCR扩增tpN15基因,构建tpN15基因原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rTpN15表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rTpN15,Western blot鉴定rTpN15的免疫反应性。以rT-pN15为包被抗原,建立rTpN15-ELISA并用于检测138例梅毒病人血清,其检测结果与RPR和TPHA进行比较。结果:克隆的tpn15基因与GenBank中相关序列相似性为100%。rTpN15表达量为细菌总蛋白的23.4%。提纯的rTpN15在SDS-PAGE后显示为单一的蛋白条带。TPHA阳性的梅毒病人血清能有效识别rTpN15并与之结合。rTpN15-ELISA对梅毒病人血清标本检测阳性率为96.4%(133/138),与TPHA检测阳性率(97.8%,135/138)相近(P>0.05),rTpN15-ELISA和TPHA检测阳性率均显著高于TRUST(82.6%,114/138)(P<0.01)。结论:本研究中成功地克隆并构建了梅毒螺旋体tpN15基因及其原核表达系统。以rTpN15为包被抗原的rTpN15-ELISA可作为快速、简便、敏感和特异的梅毒血清学筛查方法。