基于IL-6介导的JAK1/STAT3信号通路探讨竹叶石膏汤合清气化痰丸对COPD大鼠的改善作用

目的探讨竹叶石膏汤合清气化痰丸对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠IL-6介导JAK1/STAT3信号通路的调控作用。方法将48只大鼠随机分为正常组,模型组,中药低、中、高剂量组(5、10、15 g/kg竹叶石膏汤合清气化痰丸)及中药低、中、高剂量(5、10、15 g/kg竹叶石膏汤合清气化痰丸)+伊他替尼(30 mg/kg)组,每组8只。采用气道滴注脂多糖(LPS)联合烟熏方法建立COPD模型,造模28 d后给药干预。给药2周后,采用肺功能检测仪测定肺功能指标[吸气峰流速(PIF)、呼气峰流速(PEF)、分钟通气量(MV)],HE染色观察肺组织病理变化,RT-qPCR、免疫印迹分析和免疫组化法检测肺组织IL-6、JAK1、STAT3、SOCS3 mRNA和蛋白表达。结果与模型组比较,中药各剂量组PIF、PEF、MV增加(P<0.05),肺组织炎症细胞浸润和充血水肿减轻,肺大泡减少,肺泡腔的破坏、扩张和融合得到缓解,IL-6、JAK1、STAT3 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),SOCS3 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05);给予伊他替尼干预后,中药各剂量组的作用均被逆转(P<0.05)。结论竹叶石膏汤合清气化痰丸可下调IL-6介导的JAK/STAT信号通路过度表达和持续活化,并抑制IL-6表达,减轻气道炎症,抑制COPD症状。

麻杏石甘汤对咳嗽变异型哮喘大鼠IL-6/STAT3信号通路及TRPV1感受器的影响

【目的】探讨麻杏石甘汤对咳嗽变异型哮喘(CVA)大鼠的治疗作用及机制。【方法】将60只大鼠随机分为正常组,模型组,麻杏石甘汤低、高剂量组,麻杏石甘汤高剂量+信号转导和转录激活因子3(STAT3)激活剂Colivelin(Col)组,每组12只。除正常组外,其他各组大鼠采用腹腔注射卵清蛋白结合艾条熏蒸法构建CVA模型。对应治疗后,观察大鼠体征和咳嗽次数,肺功能仪检测气道阻力(RE),Diff-Quik染色计数嗜酸性粒细胞(EOS),苏木素-伊红(HE)染色法观察肺、支气管组织病理学特征,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测肺组织单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量,Western Blot法检测肺组织白细胞介素6(IL-6)、STAT3、瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)蛋白表达水平。【结果】与正常组比较,模型组大鼠出现明显哮喘症状,肺组织可见炎性细胞浸润严重,支气管上皮细胞坏死、纤毛粘连、黏液多,RE,EOS数目,MCP-1、TNF-α含量,以及IL-6、STAT3、TRPV1蛋白表达水平均升高(P<0.05);与模型组比较,麻杏石甘汤低、高剂量组大鼠哮喘症状明显改善,肺及支气管损伤减轻,RE,EOS数目,MCP-1、TNF-α含量以及IL-6、STAT3、TRPV1蛋白表达水平呈剂量依赖性降低(P<0.05);与麻杏石甘汤高剂量组比较,麻杏石甘汤高剂量+Col组大鼠哮喘加重,肺及支气管损伤加重,RE,EOS数目,MCP-1、TNF-α含量以及IL-6、STAT3、TRPV1蛋白表达水平升高(P<0.05)。【结论】麻杏石甘汤可有效改善CVA大鼠症状,其机制与抑制IL-6/STAT3信号通路及TRPV1高表达有关。

苦豆碱调节IL-6/JAK1/STAT3信号通路对结直肠癌细胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影响

目的:探讨苦豆碱(ALO)调节IL-6/酪氨酸激酶1(JAK1)/信号转导和转录激活因子3(STAT3)通路对结直肠癌(CRC)细胞行为的影响。方法:SW480分为CK组(正常培养的SW480细胞)、ALO低剂量组(ALO-L组,0.2 mmol/L)、ALO中剂量组(ALO-M组,0.4 mmol/L)、ALO高剂量组(ALO-H组,0.8 mmol/L)、ALO-H+激活剂(IL-6激活剂重组人IL-6蛋白)组(0.8 mmol/L+100 ng/ml)。CCK-8、平板克隆实验检测SW480细胞增殖;流式细胞术检测SW480细胞凋亡;Western blot检测细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、IL-6、p-JAK1、p-STAT3蛋白表达。将自然杀伤细胞NK-92MI分别与上述5组细胞共培养,并依次命名为CK共培养组、ALO-L共培养组、ALO-M共培养组、ALO-H共培养组、ALO-H+激活剂共培养组,检测共培养细胞上清液中TNF-α、IFN-γ水平及共培养体系中NK-92MI的免疫杀伤率。结果:与CK组相比,ALO-L组、ALO-M组、ALO-H组OD_(450)值、克隆形成率、PCNA、IL-6、p-JAK1、p-STAT3蛋白表达降低,细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高,且呈剂量依赖性(P<0.05);与ALO-H组相比,ALO-H+激活剂组SW480细胞OD_(450)值、克隆形成率、PCNA、IL-6、p-JAK1、p-STAT3蛋白表达升高,细胞凋亡率、Bax蛋白表达降低(P<0.05);ALO-L共培养组、ALO-M共培养组、ALO-H共培养组上清中TNF-α、IFN-γ水平、NK-92MI细胞免疫杀伤率高于CK共培养组,且呈剂量依赖性(P<0.05);与ALO-H共培养组相比,ALO-H+激活剂共培养组上清中TNF-α、IFN-γ水平、细胞免疫杀伤率降低(P<0.05)。结论:ALO可能通过抑制IL-6/JAK1/STAT3信号通路抑制SW480细胞增殖、免疫逃逸,促进细胞凋亡。

苗药金乌健骨胶囊对胶原诱导关节炎模型大鼠肠道、滑膜炎症及IL-17α/TRAF6/NF-κB信号通路的影响

目的探讨苗药金乌健骨胶囊对胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型大鼠肠道、滑膜炎症及参与NF-κB信号通路基因IL-17受体信号分子ACT1(nuclear factor kappa B activator 1,ACT1)、泛素化TRAF6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)、转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)、核因子-κB上游激酶(IκB kinaseα,IKKα)、核因子κB/p65、核因子κB/p50表达的影响。方法将70只SPF级6~8周龄雌性Wistar大鼠随机分为7组,分别为空白对照组、模型组、金乌健骨胶囊低剂量组、金乌健骨胶囊中剂量组、金乌健骨胶囊高剂量组、甲氨蝶呤组及益生菌组,每组10只。适应性喂养后除空白对照组外,其余6组构建CIA模型,两次免疫造模成功后分别进行药物金乌健骨胶囊、甲氨蝶呤、益生菌灌胃治疗,治疗4周后静脉取血,处死大鼠,分离大鼠滑膜组织及肠道组织。利用HE染色法检测大鼠滑膜及大肠组织病理情况;ELISA法检测大鼠血清TGF-β1、IL-1α、IL-17α、IL-21、IL-23的含量;Western blot法检测大鼠肠道组织ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50蛋白的表达水平;RT-qPCR法检测大鼠肠道ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50基因的表达情况。结果滑膜病理结果显示,与模型组相比,金乌健骨胶囊中、高剂量组和甲氨蝶呤组炎性浸润、增生、血管新生组织有明显改善;肠道病理结果显示,与模型组相比,金乌健骨胶囊低、中、高剂量组及甲氨蝶呤组、益生菌组肠道组织细胞可见少量炎性细胞浸润,肠道组织细胞病变情况较模型组有不同程度的改善;ELISA结果显示,与模型组相比,各给药组血清含量显著降低(P<0.05或P<0.01);Western blot结果显示,各给药组大鼠肠道组织ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50的蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01);RT-qPCR结果显示,各给药组ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50基因的表达显著降低(P<0.05或P<0.01);金乌健骨胶囊高剂量组的作用最佳。结论苗药金乌健骨胶囊能够减轻CIA大鼠肠道、滑膜炎症,同时能够影响肠道IL-17α/TRAF6/NF-κB信号途径相关基因的表达情况。

ALDH3A1通过IL-6/STAT3信号通路激活GMA诱导的恶性转化16HBE细胞上皮间充质转化

目的:甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)作为一种广泛应用于各种复合材料合成和改性的化学物,已被国际癌症研究机构(IARC)归类为2A类致癌物,但其具体的致癌机制仍不明确。本研究拟探讨GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化的关键分子机制是否与醛脱氢酶3A1(ALDH3A1)的表达变化相关。方法:在课题组前期建立的GMA诱导的恶性转化16HBE细胞模型中使用瞬时转染技术过表达ALDH3A1后,分别通过Western blot和qPCR法分析IL-6/磷酸化转录3激活剂(STAT3)通路及上皮间充质转化(EMT)过程标志物E钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、Snail的蛋白和mRNA表达情况。结果:Western blot和qPCR检测结果表明,与对照组相比,ALDH3A1过表达组细胞中E-cadherin表达增加,而IL-6、STAT3、p-STAT3、MMP3及Snail均表达降低(P<0.05),同时MMP3、Snail、Vimentin转录水平下调(P<0.05)。ALDH3A1通过抑制IL-6/STAT3通路激活,减弱了GMA诱导的恶性转化16HBE细胞中EMT过程多个关键蛋白的表达。结论:ALDH3A1与GMA诱导的16HBE细胞恶性转化过程密切相关,并且通过IL-6/STAT3通路激活促使细胞上皮间充质转化能力增强。本研究的结果将有助于阐明GMA的致癌机制,并为GMA暴露的健康效应评估提供了潜在的生物标志物。

异甘草素抑制RANKL/RANK/TRAF6信号通路对骨质疏松大鼠成骨细胞分化的影响

目的探究异甘草素对骨质疏松(OP)大鼠成骨细胞分化的影响是否与调控核因子-κB受体活化体配体(RANKL)/核因子-κB受体活化体(RANK)/肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)信号通路有关。方法采用去势法建立绝经后OP大鼠模型,造模2周后将大鼠随机分为模型组、阳性组(戊酸雌二醇0.09 mg/kg)、异甘草素低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(40 mg/kg)剂量组,每组10只,另取10只大鼠作为假手术组。给药结束后采用ELISA法检测大鼠血清中碱性磷酸酶(ALP)、雌二醇(E_(2))水平;Micro-CT扫描观察骨微结构指标;HE染色观察股骨组织病理学;免疫组化法检测大鼠股骨Runt相关转录因子2(Runx2)蛋白表达;Western Blot法检测大鼠股骨RANKL、RANK、TRAF6蛋白表达。结果与模型组比,阳性组与异甘草素各剂量组大鼠骨组织病变明显减轻,可见新生骨小梁;ALP[(107.94±9.83)U/L、(75.27±7.51)U/L、(89.35±9.14)U/L、(106.33±10.02)U/L比(53.79±5.62)U/L]、E_(2)[(27.71±2.67)pg/mL、(18.36±1.82)pg/mL、(23.65±2.28)pg/mL、(27.46±2.71)pg/mL比(14.64±1.59)pg/mL]水平,Tb.Th[(0.36±0.04)mm、(0.23±0.02)mm、(0.28±0.03)mm、(0.36±0.03)mm比(0.12±0.01)mm]、Tb.N[(4.45±0.44)1/mm、(2.67±0.27)1/mm、(3.36±0.34)1/mm、(4.41±0.44)1/mm比(1.51±0.12)1/mm]、BMD[(0.37±0.04)g/cm^(2)、(0.22±0.02)g/cm^(2)、(0.29±0.03)g/cm^(2)、(0.38±0.03)g/cm^(2)比(0.14±0.01)g/cm^(2)]、BV/TV[(11.94±1.23)%、(7.12±0.70)%、(8.49±0.85)%、(11.77±1.16)%比(5.75±0.61)%]以及Runx2表达[(0.84±0.08)、(0.41±0.04)、(0.59±0.06)、(0.82±0.08)比(0.27±0.03)]升高(P<0.05),Tb.Sp[(0.25±0.02)mm、(0.43±0.04)mm、(0.34±0.03)mm、(0.23±0.02)mm比(0.56±0.06)mm]以及RANKL[(0.42±0.04)、(0.86±0.08)、(0.64±0.06)、(0.45±0.04)比(1.09±0.11)]、RANK[(0.39±0.04)、(0.81±0.08)、(0.67±0.06)、(0.41±0.04)比(1.03±0.10)]、TRAF6[(0.47±0.05)、(0.77±0.08)、(0.61±0.06)、(0.49±0.05)比(0.96±0.09)]蛋白表达降低(P<0.05),且异甘草素呈剂量依赖性。结论异甘草素可能通过抑制RANKL/RANK/TRAF6信号通路,促进成骨细胞分化,改善股骨病变,有效发挥对OP的治疗作用。

SIRT6通过TGF-β1/Smad信号通路调控瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭和胶原合成

目的 探讨沉默信息调节因子6(silent information regulator 6, SIRT6)对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭和胶原合成的调控作用和分子机制。方法 收集瘢痕疙瘩和正常皮肤样本,采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测SIRT6 mRNA表达水平,采用Western blot检测SIRT6蛋白表达水平。采取组织块贴壁法从瘢痕疙瘩组织中分离养成纤维细胞。构建SIRT6重组腺病毒(adenovirus, Ad),感染瘢痕疙瘩成纤维细胞实现SIRT6过表达。将瘢痕疙瘩成纤维细胞分为空白对照组、Ad-NC组和Ad-SIRT6组。采用RT-qPCR检测SIRT6 mRNA表达水平。采用Western blot检测SIRT6、Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,ColⅠ)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和SMAD家族成员2/3(SMAD family member 2/3,Smad2/3)蛋白的表达水平。采用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine, EdU)方法检测细胞增殖。采用Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果 与正常皮肤组织比较,SIRT6在瘢痕疙瘩组织中表达水平显著降低(P<0.01)。与空白组和Ad-NC组比较,Ad-SIRT6组中SIRT6表达量显著升高,细胞增殖显著减少,细胞侵袭水平显著降低,ColⅠ、TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表达量显著下降(均P<0.01)。结论 过表达SIRT6通过下调TGF-β1/Smad信号通路抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭和胶原合成。

miR-146a-5p抑制TRAF6/NF-кB信号通路影响滋养细胞的炎症反应

目的:探讨微小核糖核酸(miR)-146a-5p与子痫前期的关系及作用机制。方法:对体外培养绒毛膜癌细胞JEG-3,经脂多糖(LPS)诱导后,与空白对照组相比,检测在LPS诱导的JEG-3细胞中miR-146a-5p和TRAF6的表达。设计分组分为control组、LPS组、miR-146a-5p mimic组、miR-146a-5p inhibitor组。通过QPCR定量检测各组JEG-3细胞中miR-146a-5p以及白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-a(TNF-α)的mRNA水平;利用Western Blot检测JEG-3细胞内TRAF6/NF-κB通路相关蛋白的表达。结果:(1)miR-146a-5p mimic组的miR-146a-5p表达明显高于其余3组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)与对照组相比,LPS诱导的JEG-3细胞中miR-146a-5p的表达量增加,TRAF6表达量明显下调(P<0.05)。(3)与对照组比较,加入miR-146a mimic后IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表达水平明显下降(P<0.05),加入miR-146a inhibitor后IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表达水平明显增加(P<0.05),与LPS组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。(4)Western Blot结果显示加入miR-146a mimic后JEG-3细胞内TRAF6、NF-κB蛋白的表达较对照组明显下降;加入miR-146a inhibitor后JEG-3细胞内TRAF6、NF-κB蛋白的表达则明显升高。结论:miR-146-5p可能通过抑制TRAF6/NF-κB信号通路影响子痫前期母胎界面的炎症反应。

TRAF6在B淋巴瘤细胞系NF-κB和AP-1信号传导通路中的作用

目的利用人B淋巴瘤细胞系模型探讨TRAF6在调控NF-κB和AP-1信号系统中的作用。方法将融合有黄色荧光素(YFP)的功能缺失型TRAF6(DN-TRAF6)质粒和小干扰RNA-TRAF6质粒转染至人类B淋巴细胞系,过夜培养后经流式细胞仪或G418筛选阳性转染细胞,通过Western blot、ELISA等方法研究TRAF6对NF-κB通路中IκBα磷酸化和转录因子(P65,P50和c-Rel)向细胞核内转移以及AP-1通路中ERK、JNK、P38磷酸化和转录因子(C-FOS,C-JUN,ATF和CREB)向细胞核内转移等的影响。结果B细胞过度表达DN-TRAF6或转染小干扰RNA-TRAF6均可抑制IκBα和JNK的磷酸化水平以及P65、P50、c-Rel和c-Fos、C-JUN的核内转录。结论TRAF6可选择性地作用于人B淋巴细胞的NF-κB和AP-1信号传导系统中部分激酶,在上述两条信号系统活化中起重要作用。

白藜芦醇激活PI3K/Akt信号通路与老年缺血性脑卒中大鼠血清IL-6、IL-1β含量的分子机制

目的 探讨白藜芦醇通过激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路调控老年脑缺血卒中大鼠血清白细胞介素(IL)-6、IL-1β含量的分子机制。方法 21月龄雄性老年SD大鼠构建老年缺血性脑卒中大鼠模型,用白藜芦醇25 mg/(kg·d)处理。36只大鼠分为Control组(正常大鼠)、大脑中动物闭塞(MCAO)组、白藜芦醇组各12只。2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色评价脑梗死体积,进行一般神经系统行为学评分,观察模型构建情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测老年缺血性脑卒中大鼠血清IL-6和IL-1β表达水平;TUNEL染色观察老年缺血性脑卒中脑组织凋亡水平,Western印迹检测PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白水平。结果 与Control组相比,MCAO组脑梗死面积显著增多,神经行为学评分明显升高,血清中IL-6和IL-1β表达水平明显升高,脑组织凋亡水平明显升高及脑组织PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的表达水平明显降低(均P<0.05);与MCAO组相比,白藜芦醇组脑梗死面积明显降低,神经行为学评分明显降低,血清IL-6和IL-1β表达水平明显降低,脑组织凋亡水平明显降低及脑组织PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt表达水平明显升高(均P<0.05)。结论 白藜芦醇可以通过激活PI3K/Akt信号通路抑制老年缺血性脑卒中大鼠血清IL-6、IL-1β含量,改善神经学功能。

银杏叶总黄酮对缺氧条件下大鼠星型胶质细胞活力、细胞凋亡率及IPS-1/TRAF6信号通路的影响

目的:探讨银杏叶总黄酮对缺氧条件下大鼠星型胶质细胞活力、细胞凋亡率及干扰素β启动子刺激因子1(IPS-1)/肿瘤坏死因子TNF受体相关因子6(TRAF6)信号通路的影响。方法:设立大鼠星型胶质细胞对照组(培养环境为20%O2、5%CO2、75%N2)、缺氧组(培养环境为1%O2、5%CO2、94%N2)、银杏叶总黄酮低、中、高剂量组(终浓度100,200,400μg·ml^-1)。培养结束后,测定各组细胞活力、凋亡水平、细胞周期、IPS-1、TRAF6 mRNA和蛋白水平。结果:与对照组比较,缺氧组光密度(OD)值、存活率水平显著降低(P<0.05),凋亡率、G1期水平、IPS-1、TRAF6 mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.05);与缺氧组比较,银杏叶总黄酮各剂量组OD值、存活率水平显著升高(P<0.05),凋亡率、G1期水平、IPS-1、TRAF6 mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.05);且各指标变化与银杏叶总黄酮浓度呈正相关(P<0.05)。结论:银杏叶总黄酮能提高缺氧条件下大鼠星型胶质细胞活力、抑制其凋亡;其机制与银杏叶总黄酮抑制星型胶质细胞IPS-1、TRAF6 mRNA和蛋白表达水平有关。

延龄草总皂苷通过调控GRP78/IRE1α/TRAF2/JNK信号通路抑制内质网应激而减轻PSCI大鼠海马神经元损伤

目的:探讨延龄草总皂苷(TST)对卒中后认知障碍(PSCI)大鼠海马神经元的保护作用及分子机制。方法:将采用改良Zea Longa线栓法造模成功的大鼠随机分为模型(model)组、TST(100 mg/kg)组和盐酸多奈哌齐(DON;0.45 mg/kg)组,另设假手术(sham)组,每组10只,连续给药4周。采用Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力;TTC染色检测大鼠脑梗死体积变化,HE、Nissl和TUNEL染色观察大鼠海马组织神经元病理变化;免疫组化及Western blot检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、肌醇需求酶1α(IRE1α)、肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、胱天蛋白酶12(caspase-12)、Bax和Bcl-2的蛋白水平。结果:与sham组相比,model组大鼠逃避潜伏期显著延长,穿越平台次数及目标象限停留时间显著减少(P<0.01);大鼠脑梗死体积显著增大,神经元尼氏小体数量显著减少,凋亡细胞显著增多;海马组织中GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK、caspase-12和Bax蛋白水平显著升高,Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.01)。与model组比较,TST组及DON组大鼠逃避潜伏期显著缩短,穿越平台次数及目标象限停留时间显著增加(P<0.01);大鼠脑梗死体积显著缩小,神经元尼氏小体数量显著增多,凋亡细胞显著减少;GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK、caspase-12和Bax蛋白水平显著降低,Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.01)。结论:TST对PSCI大鼠海马神经元具有保护作用,其机制可能与减轻内质网应激、减少神经元凋亡并抑制GRP78/IRE1α/TRAF2/JNK信号通路有关。

基于mTOR/S6K1通路探究CXCR3对糖尿病肾病足细胞损伤、凋亡、自噬的影响

目的 探究趋化因子受体(CXCR)3对糖尿病肾病足细胞损伤、凋亡、自噬的影响及其作用机制。方法 将分化成熟的小鼠肾脏足细胞MPC-5分为对照组,模型组,si-NC组和si-CXCR3组,噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞24 h、48 h和72 h细胞活力,流式细胞法检测各组细胞凋亡水平,Western印迹检测细胞凋亡关键蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3表达水平,ELISA法检测各组细胞白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8,肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,qPCR及Western印迹检测各组细胞自噬相关蛋白(beclin)1、人自噬相关蛋白(ATG)5及ATG7表达水平,同时检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/蛋白核糖体S6蛋白激酶(mTOR/S6K1)信号通路关键蛋白的蛋白表达水平及其磷酸化修饰水平。结果 与对照组相比,模型组和si-NC组细胞增殖受到显著抑制,并且随着时间增加抑制能力增强,与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组细胞增殖显著提高(P<0.05);与对照组相比,模型组和si-NC组细胞凋亡均显著增加(P<0.05);与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组细胞凋亡显著降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组和si-NC组细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α释放显著增加(P<0.05);与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α显著降低,但仍高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,模型组和si-NC组细胞自噬相关蛋白Beclin1、ATG5及ATG7表达水平显著降低,而与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组显著升高(P<0.05);与对照组相比,模型组和si-NC组细胞mTOR、S6K1蛋白表达水平显著升高,其磷酸化修饰也相应增加,而与模型组和si-NC组相比,si-CXCR3组细胞mTOR,S6K1蛋白表达水平显著降低,磷酸化修饰也相应降低(P<0.05)。结论 沉默CXCR3可以提高小鼠肾足组细胞活性,降低细胞凋亡,减少炎症因子释放,对肾足细胞具有保护作用,其机制可能通过增强自噬,调控mTOR/S6K1信号通路活性及磷酸化修饰相关。

萝卜硫素通过下调Traf6/TAK1信号传导抑制UVB诱导黑素生成的机制研究

目的:研究萝卜硫素对中波紫外线(UVB)照射后黑素细胞产生黑素能力的抑制效应及其对Traf6/TAK1信号传导的影响。方法:采用人表皮黑素PIG1细胞为研究模型,分为对照组(Control)、模型组(Model,UVB照射)、萝卜硫素处理组(10、20、40μM)。CCK8法分析PIG1细胞增殖情况,氢氧化钠裂解法分析黑素含量,酶联免疫吸附试验(ELISA)分析优黑素含量,Westernblot技术检测小眼畸形相关转录因子(MITF)、酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)、TRP-2、肿瘤坏死因子相关受体因子6(Traf6)及转录生长因子β-活化激酶1(TAK1)表达。结果:与对照组比较,UVB照射能诱导PIG1细胞黑素及优黑素含量显著升高(P<0.05),还能促使MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Traf6及p-TAK1蛋白表达水平显著增高(P<0.05);与模型组比较,不同浓度萝卜硫素能降低PIG1细胞黑素及优黑素的生成(P<0.05),还能显著抑制MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Traf6及p-TAK1蛋白表达(P<0.05),呈现出剂量依赖性。结论:萝卜硫素通过抑制Traf6/TAK1信号传导降低UVB诱导PIG1细胞黑素生成。

半滑舌鳎TRAF6基因和TAK1基因的克隆及表达分析

本研究通过同源克隆和RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)和转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)的c DNA全长,并分析了其在不同组织和早期胚胎发育时期的表达情况。结果表明,TRAF6 c DNA全长1956 bp,开放阅读框(ORF)为1731 bp,编码576个氨基酸。二级结构预测显示TRAF6具有保守的蛋白结构域:N端的RING结构,两个锌指结构以及C端的环–环(coiled-coil)α螺旋结构和高度保守的MATH同源结构。TAK1 c DNA全长2519 bp,ORF为1731 bp,编码576个氨基酸。TAK1的蛋白结构域包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶激活结构域和C端的环–环(coiled-coil)α螺旋结构域。系统进化树分析表明,半滑舌鳎TRAF6和TAK1分别与牙鲆(Paralichthys olivaceus)TRAF6和TAK1聚为一支,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,TRAF6和TAK1在所检测的8种组织中都有表达,TRAF6在鳃中的表达最高,肠中也有较高的表达;TAK1在心脏中的表达量最高,其次是肾。TRAF6和TAK1在鳃、肾等免疫器官中的高表达,与其在Toll样受体信号通路中的重要作用是一致的。对TRAF6和TAK1在早期胚胎发育时期的表达情况进行检测,结果显示,在未受精卵中可检测到TRAF6和TAK1,提示了这两种免疫分子的母源性m RNA遗传的可能性。免疫分子母源性m RNA可能参与发育过程,也可能参与构建免疫体系,以保护胚胎或仔鱼免受病原体的侵袭。

槲皮素通过抑制TGF-β/TAK1/JNK和TGF-β/Smad2信号通路发挥抗肝纤维化的作用

目的探讨槲皮素抗肝纤维化的潜在作用机制。方法通过腹腔注射10 mg·kg^(-1)二甲基亚硝胺构建大鼠肝纤维化模型,于造模第3周开始灌胃槲皮素(12.5、25、50 mg·kg^(-1))治疗,造模第4周末处死;对肝组织进行HE和胶原染色,检测羟脯氨酸含量;检测肝功能指标和肝纤维化指标的变化;实时定量PCR检测肝星状细胞活化相关因子的表达水平;免疫组织化学法测定肝组织中TGF-β/TAK1/JNK和TGF-β/Smad2信号途径相关蛋白表达水平的变化。采用MTT法和Western blot法检测槲皮素对大鼠肝星状细胞系HSC-T6的增殖的影响以及对TGF-β1诱导的TAK1、JNK、Smad2蛋白磷酸化的抑制作用。结果与模型组相比,槲皮素25和50 mg·kg^(-1)组大鼠肝纤维化程度明显降低;槲皮素(20和40μmol·L^(-1))能显著抑制HSC-T6细胞的增殖,并能有效地降低TGF-β/TAK1/JNK和TGF-β/Smad2信号途径相关蛋白磷酸化程度。结论槲皮素可通过调节TGF-β/TAK1/JNK和TGF-β/Smad2信号通路影响肝星状细胞活化以发挥抗肝纤维化作用。

TRAF6,TAK1和TGF-β基因在弥漫大B细胞淋巴瘤患者化疗前后外周血单个核细胞中的表达

本研究检测弥漫大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)患者外周血单个核细胞中TRAF6、TAK1及TGF-β基因在化疗前后的表达变化,探讨化疗对TRAF6/TAK1信号通路活性的影响。采用Ct值比较法,通过SYBR Green II实时定量PCR检测38例DLBCL患者化疗前及化疗2周期后外周血单个核细胞(PBMNC)中TRAF6、TAK1及TGF-β在mRNA的表达水平,并以12例健康人PBMNC作为对照。结果表明:DLBCL患者治疗前后PBMNC中TRAF6、TAK1和TGF-βmRNA表达水平均高于正常人。治疗前患者TRAF6及TAK1基因表达水平与正常人相比未发现统计学差异(P>0.05),治疗后这两基因的表达明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05);在此同时治疗后与治疗前相比,这两基因的表达水平也具明显统计学差异(P<0.05),且这两基因的表达水平呈明显正相关,而TGF-β基因治疗后较治疗前明显下降,差异具统计学差异(P<0.05)。结论:DLBCL患者化疗后TRAF6/TAK1信号通路的活性明显增高,而TGF-β基因治疗后则较治疗前明显下降。

mTOR Complex1-S6K1信号通路在2型糖尿病发生发展中的作用

随着人们生活水平的提高，全身代谢性疾病逐渐成为影响人类生活质量的主要疾病之一。在近年的调查研究中发现，糖尿病的发生率较过去20年间呈数倍增加，尤其糖尿病并发症引起的死亡率较前大大提升。所以深入研究糖尿病的发生、发展机制成为目前治疗糖尿病的关键。mTOR信号通路是雷帕霉素的靶分子，是丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，在感受营养信号、调节细胞生长和增殖中起关键性的作用。mTORComplexl-S6K1信号通路可受如生长因子、激素、能量信号等多种因素的调节，在糖尿病的发生、发展中起重要作用。本文将详细阐述mTORComplexl-S6K1信号通路在糖尿病的发生发展中的作用机制。

TRAF1以及CD30-TRAF1信号通路在B细胞性霍奇金淋巴瘤细胞中的作用分析

目的探讨B细胞性霍奇金淋巴瘤细胞中肿瘤坏死因子受体相关因子1(TRAF1)和CD30-TRAF1信号通路的作用。方法选取B细胞性霍奇金淋巴瘤细胞株L428进行培养,采用荧光实时定量(RT-PCR)检测L428细胞TRAF1 mRNA表达情况,Western blot检测TRAF1蛋白表达水平,同时检测CD30配体对TRAF1的影响以及TRAF1对L428细胞凋亡的影响。结果 L428细胞TRAF1 mRNA和蛋白相对表达量分别为3.64±1.03和0.97±0.22,明显高于对照细胞的0.72±0.21和0.21±0.09,差异有统计学意义(P<0.05);通过荧光实时定量RT-PCR检测,L428细胞TRAF1 mRNA和蛋白相对表达量在CD30L作用前分别为3.62±0.34和2.29±0.27,CD30L作用8 h后增加为6.54±0.28和4.12±0.36,差异有统计学意义(P<0.05);转染TRAF1 siRNA后,L428细胞凋亡率为(29.17±6.38)%,明显高于转染对照的(4.27±1.06)%,差异有统计学意义(P<0.05);转染对照TRAF1蛋白相对表达为2.44±0.94,明显高于转染TRAF1 siRNA L428细胞的0.17±0.04,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 B细胞性霍奇金淋巴瘤细胞中TRAF1表达增加,可能参与了霍奇金淋巴瘤细胞的抗凋亡过程,受到CD30信号通路的调控。

五味子乙素介导Traf6/NF-κB信号通路抑制心肌细胞肥大实验研究

目的:研究五味子乙素抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导心肌细胞肥大的作用及其机制。方法:原代培养心肌细胞,用LPS(1 mg/L)诱导心肌细胞肥大,考察IκBα抑制剂BAY11-7082和不同剂量五味子乙素对心肌细胞肥大的影响。采用计算机图像分析系统观察细胞大小;考马斯亮蓝法分析细胞总蛋白量;ELISA试剂盒检测白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)表达量;免疫印迹技术检测心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和Traf6/NF-κB信号通路蛋白表达水平。结果:与LPS诱导组相比,五味子乙素和BAY11-7082均可以抑制LPS诱导的心肌细胞肥大,体现在蛋白含量降低,细胞体积减小,ANP蛋白表达降低(P<0.05);五味子乙素还能够降低炎症反应,表现在细胞外液中炎症因子IL-6和TNF-α水平降低(P<0.05),Traf6、p65蛋白表达量降低(P<0.05)及IκBα蛋白水平升高(P<0.05),且呈浓度依赖性。此外,高剂量五味子乙素与BAY11-7082对心肌细胞肥大的保护作用相近。结论:五味子乙素能抑制LPS诱导原代心肌细胞肥大,对心肌细胞的保护作用主要通过抑制Traf6/NF-κB信号通路的活化来实现。