TAT-EGFP融合蛋白的表达及其在小鼠体内跨膜转导与分布的研究

目的:建立TAT-EGFP融合蛋白在原核细胞中表达的试验方法,探讨该融合蛋白经过胎盘屏障后在小鼠体内跨越各种生物膜转导及分布情况。方法:将重组表达载体pET32-TAT-EGFP转化E.ColiBL21,得到稳定表达的融合蛋白,纯化后注入孕鼠腹腔内,注射后第3天分别取母鼠和仔鼠组织,并做快速冷冻切片,观察融合蛋白在小鼠体内的分布。结果:成功表达了相对分子质量为32×103的TAT-EGFP融合蛋白。该融合蛋白能在小鼠不同组织细胞内分布,在小肠上皮分布最为明显,并能透过胎盘及血脑屏障。结论:TAT介导的EGFP可在小鼠体内广泛跨膜转导分布,为进一步研究其他大分子活性物质进入细胞及其功能奠定了良好基础。

大肠杆菌Tat转运酶的研究进展

TatA、TatB和TatC是大肠杆菌Tat转运酶的组成成分。研究表明各Tat蛋白具有不同的功能区域,TatA和TatB蛋白功能重要的位点位于N末端的穿膜片断、其后的双极性α-螺旋和铰链区。TatC的序列保守性低,N末端穿膜片断和位于胞质内的第一环区对转运是必需的。Tat转运酶各成分相互结合成复合物形式并相互依赖。TatA在细胞中高表达并自身聚合形成数量不等的同聚物,具有稳定TatBC复合物的作用,TatB有稳定TatC的功能,TatB和TatC两者结合形成二聚体。实验表明,TatA复合物形成转运通道,TatBC复合物通过TatC蛋白识别底物的信号肽并与底物结合,再在TatB介导下与TatA复合物结合形成具有活性的转运酶。

TAT-Cloan-DH-EGFP融合蛋白的原核表达及其在舞毒蛾幼虫体内的跨膜转导

【目的】为了探究滞育激素经昆虫取食的生物效应,需设计一种能够加速跨膜运输的融合蛋白,克服经昆虫消化道的降解作用。【方法】本研究以分月扇舟蛾Clostera anastomosis滞育激素基因Cloan-DH和TAT穿膜肽编码序列为基础,构建TAT-Cloan-DH融合基因;然后以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为标签,构建在p ET-22b载体中。在0.2 mmol/L IPTG诱导下,在大肠杆菌Escherichia coli BL21 Rosetta(DE3)中表达出TAT-CloanDH-EGFP融合蛋白。再分别将表达有TAT-Cloan-DH-EGFP和EGFP融合蛋白的大肠杆菌BL21菌体拌入人工饲料,经舞毒蛾Lymantria dispar幼虫持续取食0,8,24,48,72和90 h后,随机挑选试虫进行组织固定并制作石蜡切片,选取中肠所在体段切片进行组织荧光分析。【结果】37℃0.2 mmol/L IPTG诱导条件下,表达的TAT-Cloan-DH-EGFP融合蛋白的分子量为61 k D,主要以包涵体形式表达,融合蛋白约占细胞总蛋白含量的18.1%;随着试虫取食含TAT-Cloan-DHEGFP融合蛋白饲料的增加,虫体组织的绿色荧光强度逐渐增加,取食72 h后,组织荧光强度达到最高。【结论】实验结果说明融合蛋白TAT-Cloan-DH-EGFP可以通过消化道横向跨膜运输,到达虫体其他组织,且该过程与蛋白的摄入量成比例。

肠侵袭性大肠埃希菌Tat蛋白运输系统与其生理功能关系研究

目的构建TatABC基因缺失株,并探讨其与肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)生理功能的关系。方法利用一步法基因缺失方法,敲除EIEC菌株的TatABC基因,探索该基因对EIEC形态、生长、生化及跨膜转运等生理功能的影响。结果TatABC基因缺失株的EIEC在镜下呈链状排列,在LB培养基上生长显著变慢;生化反应无明显变化;在厌氧条件下,由于不能转运TMAO还原酶,失去了在M9培养基上下生长的能力。结论 EIEC的Tat蛋白运输系统与其生理功能密切相关。

GLUT1在甲基苯丙胺与HIV-Tat蛋白协同诱导大鼠血脑屏障通透性改变中的作用研究

目的观察甲基苯丙胺(METH)与HIV-Tat蛋白协同诱导大鼠血脑屏障通透性的改变,探讨GLUT1在METH与HIV-Tat蛋白协同诱导血脑屏障通透性改变中的作用。方法40只雄性SD大鼠随机分成4组,对照组(每日10mL·kg^-1生理盐水)、METH组、HIV-Tat蛋白组、METH+HIV-Tat蛋白组。建立血脑屏障损伤的大鼠模型:采用腹腔注射METH(每日10mg·kg^-1)和尾静脉注射HIV-Tat蛋白(每日400ng·kg^-1)的方法。模型建成功后检测各组脑区伊文思蓝(EB)的含量,并通过Western-Blotting和免疫组织化学观察各组脑中GLUT1表达情况。结果与对照组相比,METH组、HIV-Tat蛋白组和METH+HIV-Tat蛋白组脑组织的EB含量明显增加;分别与METH组和HIV-Tat组相比,METH+HIV-Tat蛋白组脑组织内EB含量明显升高。此外,免疫组化和WB结果显示,与对照组相比,METH组、HIV-Tat蛋白组和METH+HIV-Tat蛋白组表达GLUT1的水平不同程度降低(P<0.01);分别与METH组和HIV-Tat蛋白组相比,METH+HIV-Tat蛋白组GLUT1的表达水平明显降低(P<0.05)。结论METH和HIV-Tat蛋白可协同作用诱导大鼠血脑屏障通透性发生改变,而GLUT1在METH和HIV-Tat蛋白的协同作用中可起调节作用。

体内蛋白转导的研究进展

简要综述了几种能够携带药物跨越血脑屏障和细胞生物膜屏障的蛋白结构域的研究进展。

道路客运与民航地空联运网络设计模型与算法

文章针对道路客运与机场接驳的现状及存在的问题,在选定的城市候机楼与机场之间建立一个地空联运网络,通过节点重要度法对接驳班线的节点进行选择,得到备选节点的集合;以社会总成本最小为目标函数,下层采用基于Logit的随机均衡交通分配模型,构建了地空联运网络双层规划模型,并采用遗传算法进行求解分析,为机场与道路客运衔接的实施提供了一定的理论基础,具有一定的理论价值和社会实践意义。

HIV Tat_(49-57)增强人乳头瘤病毒16E7细胞毒性T细胞表位穿膜效应研究

目的探讨有穿膜序列HIV Tat_(49-57)的人乳头瘤病毒(HPV)16E7限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位融合肽的跨膜能力及其影响因素。方法在HPV16E7 HLA-A2^+/H-2k^(b+)限制性CTL表位E7_(49-57)的N末端连接穿膜肽HIV Tat_(49-57)序列,应用固相技术合成此融合肽,用间接免疫荧光与激光共聚焦显微技术,研究其穿膜能力,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测其体外诱导特异性CTL杀伤效应。结果穿膜序列HIV Tat_(49-57)可以有效促进HPV16E7_(49-57)表位肽进入BHK细胞胞浆,并呈时间、剂量依赖关系(P＜0．05)；与原表位肽相比,该融合肽有显著地激发特异性CTL活性的能力。结论在原CTL表位基础上引入穿膜序列,可以使其更快速、更有效地进入活细胞胞浆,为HPV16肽疫苗的设计提供一种新的思路。

肠侵袭性大肠杆菌tatABC基因缺失株的生物学特性

【目的】研究双精氨酸运输系统(Tat)与肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)生物学特性之间的关系。【方法】通过同源重组的方法,构建EIEC的tatABC基因缺失菌株以及互补菌株,并探索其对细菌形态、底物转运功能以及对HeLa细胞和豚鼠角膜侵袭力的影响。【结果】TatABC基因缺失株细菌形态变化明显,底物转运功能丧失,细菌侵袭力也显著减弱(缺失株侵入HeLa细胞数量明显减少,致豚鼠角膜病变能力明显减弱),而互补菌株在上述方面较接近野生株。【结论】EIEC的Tat蛋白运输系统与EIEC的生物学特性有密切关系。

双精氨酸转运(Tat)系统及其在大肠杆菌分泌表达重组蛋白中的应用

常见的分泌途径(Sec途径)是细菌中蛋白分泌跨膜转运的主要途径,而双精氨酸转运(Tat)则是另外一个蛋白分泌跨膜转运系统,该系统的特征是在分泌蛋白的信号肽中含有一个高度保守的双精氨酸基序。与Sec途径相比,Tat系统的显著优点是它只分泌已正确折叠的蛋白,而未正确折叠的蛋白则不能通过该系统分泌,这样就保证了分泌产物在结构上的正确性。因此,研究利用Tat信号肽牵引重组蛋白通过Tat系统进行分泌跨膜转运在重组蛋白的表达方面具有很好的应用前景。

降解木质纤维素放线菌的功能组学分析及工业应用前景

放线菌是一种高GC含量的革兰氏阳性细菌,在陆生、高温的木质纤维素降解生境中占据十分重要的地位.降解木质纤维素菌株的功能基因组分析发现降解纤维素的酶种类和数目相对较多,而降解半纤维素以及果胶成分的酶相对真菌较少.其中,降解纤维素的酶类主要以GH6家族外切酶为主,部分含有GH9和GH48家族的纤维素酶,基因组中还含有AA10家族的多糖裂解氧化酶,因此放线菌可通过持续性水解与氧化双重机制高效降解结晶纤维素.放线菌可通过双精氨酸转运系统快速将已正确折叠的降解酶类分泌至胞外,这些酶分子常具有多个功能结构域,具有耐高温、耐碱性以及高活力等特征.放线菌在木质纤维素降解及次级代谢产物等方面的特点与优势使得其具有巨大的工业应用前景.