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TAT-Cloan-DH-EGFP融合蛋白的原核表达及其在舞毒蛾幼虫体内的跨膜转导 被引量:1
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作者 周洲 李永丽 +1 位作者 源春彦 曲良建 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期1361-1367,共7页
【目的】为了探究滞育激素经昆虫取食的生物效应,需设计一种能够加速跨膜运输的融合蛋白,克服经昆虫消化道的降解作用。【方法】本研究以分月扇舟蛾Clostera anastomosis滞育激素基因Cloan-DH和TAT穿膜肽编码序列为基础,构建TAT-Cloan-D... 【目的】为了探究滞育激素经昆虫取食的生物效应,需设计一种能够加速跨膜运输的融合蛋白,克服经昆虫消化道的降解作用。【方法】本研究以分月扇舟蛾Clostera anastomosis滞育激素基因Cloan-DH和TAT穿膜肽编码序列为基础,构建TAT-Cloan-DH融合基因;然后以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为标签,构建在p ET-22b载体中。在0.2 mmol/L IPTG诱导下,在大肠杆菌Escherichia coli BL21 Rosetta(DE3)中表达出TAT-CloanDH-EGFP融合蛋白。再分别将表达有TAT-Cloan-DH-EGFP和EGFP融合蛋白的大肠杆菌BL21菌体拌入人工饲料,经舞毒蛾Lymantria dispar幼虫持续取食0,8,24,48,72和90 h后,随机挑选试虫进行组织固定并制作石蜡切片,选取中肠所在体段切片进行组织荧光分析。【结果】37℃0.2 mmol/L IPTG诱导条件下,表达的TAT-Cloan-DH-EGFP融合蛋白的分子量为61 k D,主要以包涵体形式表达,融合蛋白约占细胞总蛋白含量的18.1%;随着试虫取食含TAT-Cloan-DHEGFP融合蛋白饲料的增加,虫体组织的绿色荧光强度逐渐增加,取食72 h后,组织荧光强度达到最高。【结论】实验结果说明融合蛋白TAT-Cloan-DH-EGFP可以通过消化道横向跨膜运输,到达虫体其他组织,且该过程与蛋白的摄入量成比例。 展开更多
关键词 舞毒蛾 滞育激素 tat穿膜肽 蛋白转导域 融合蛋白 跨膜运输
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蜱组胺结合蛋白与渗透肽TAT在杆状病毒表达体系中的融合表达和功能分析 被引量:1
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作者 王亚楠 曹杰 +3 位作者 周勇志 张厚双 龚海燕 周金林 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期457-460,共4页
为真核融合表达亚洲璃眼蜱(H.asiaticum)唾液腺中的组胺结合蛋白(HBP)与渗透肽TAT,并研究其生物学活性,本研究将编码HBP的基因片段与编码渗透肽TAT基因片段通过酶切位点Eco RⅠ酶切连接后克隆至真核表达载体p Fast Bac HTa中,构建重组杆... 为真核融合表达亚洲璃眼蜱(H.asiaticum)唾液腺中的组胺结合蛋白(HBP)与渗透肽TAT,并研究其生物学活性,本研究将编码HBP的基因片段与编码渗透肽TAT基因片段通过酶切位点Eco RⅠ酶切连接后克隆至真核表达载体p Fast Bac HTa中,构建重组杆粒r Bac-HBP-TAT,转染至sf9昆虫细胞中,制备重组病毒并进行融合蛋白的表达。经SDS-PAGE、western blot和间接免疫荧光试验检测结果表明,HBP-TAT在Bac-to-Bac杆状病毒系统中获得稳定表达,融合蛋白约为31 ku。此外,组胺结合试验证明HBP-TAT具有与组胺结合的能力。本研究为研制新型蜱源抗组胺药物提供了实验依据。 展开更多
关键词 亚洲璃眼蜱 组胺结合蛋白 Bac-to-Bac杆状病毒系统 蛋白转导肽
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TAT-LHRH-壳聚糖/siRNA纳米复合物与巨噬细胞的相互作用 被引量:1
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作者 邵楠 董霞 +3 位作者 刘兰霞 朱敦皖 张海玲 冷希岗 《生物医学工程与临床》 CAS 2015年第4期339-344,共6页
目的评价反式转录激活因子短肽-促黄体生成激素释放激素(TAT-LHRH)修饰的低分子质量壳聚糖(LMWC)作为siRNA载体的生物安全性。方法利用琥珀亚酰胺基-3-2-硫代吡啶-丙酸酯(SPDP)共价连接TAT-LHRH双功能肽及LMWC(相对分子质量5 000~8 000... 目的评价反式转录激活因子短肽-促黄体生成激素释放激素(TAT-LHRH)修饰的低分子质量壳聚糖(LMWC)作为siRNA载体的生物安全性。方法利用琥珀亚酰胺基-3-2-硫代吡啶-丙酸酯(SPDP)共价连接TAT-LHRH双功能肽及LMWC(相对分子质量5 000~8 000;脱乙酰化程度90%),合成TAT-LHRH-壳聚糖(TLC)载体,并与未修饰的LMWC分别和非编码siRNA(序列5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)混合,合成TLC/siRNA纳米复合物和LMWC/siRNA纳米复合物。利用凝胶阻滞及光散射实验观察纳米粒的表征,并通过酶联免疫吸附分析(ELISA)、流式细胞术及体内巨噬细胞吞噬实验分析纳米复合物诱导小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7所引起的细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)的变化,以及对人巨噬细胞吞噬活性的影响。结果与未进行任何修饰的壳聚糖相比,TLC具有更好的siRNA结合能力(N/P比分别为1∶2、1∶1、2∶1、5∶1和10∶1)。以不同N/P(10∶1、20∶1)与siRNA形成纳米复合体后,其粒径分布于90~150 nm,zeta电位稳定在+2.7^+19.3 m V。含200 nmol/L siRNA的TLC/siRNA纳米复合物在24 h内未引起上述细胞因子的明显释放。体内与体外的巨噬细胞吞噬实验证明,相比未修饰壳聚糖/siRNA复合物而言,TLC/siRNA纳米复合物被巨噬细胞摄入量更高,但两者均未对吞噬活性和细胞因子生成产生明显影响。结论 TLC无明显免疫毒性,是一种有应用前景的siRNA载体。 展开更多
关键词 siRNA运输 肝癌 反式转录激活因子短肽(tat) 促黄体生成激素释放激素(LHRH) 壳聚糖 巨噬细胞
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Borf-1 protein identified as a transcriptional trans-activator of bovine foamy virus 被引量:3
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作者 Jiajian Liu Shuhong Liu +1 位作者 Qimin Chen Yunqi Geng 《Chinese Science Bulletin》 SCIE EI CAS 1999年第11期1017-1021,共5页
Bovine foamy virus (BFV), a member of the spumavirus subfamily of retroviruses,contains two open reading frames (ORF-1 and ORF-2) in addition to the genes coding for gag,po/and env. Borf-1 protein, encoded by BFV ORF-... Bovine foamy virus (BFV), a member of the spumavirus subfamily of retroviruses,contains two open reading frames (ORF-1 and ORF-2) in addition to the genes coding for gag,po/and env. Borf-1 protein, encoded by BFV ORF-1, is identified as a transcriptional transactivator, which augments gene expression directed by the viral long terminal repeat (LTR).Further investigations in transient expression assays reveal that the Borf-1 responsive elements are located in the U3 domain of the LTR, upstream from position -140 ( + 1 represents the transcription initiation site), and the BFV RU5 region has an inhibitory effect in LTR-directed gene expression. 展开更多
关键词 BOVINE foamy VIRUS (BFV )3026 China Strain transcriptionAL trans-activator transient expression assay.
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HIV-I转录因子及相关抑制剂研究进展
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作者 王霁宁 廉玉利 《辽宁师专学报(自然科学版)》 2012年第1期1-4,95,共5页
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)和获得性免疫缺陷综合症(acquiredimmunodeficiency syndrome,AIDS)仍是全球关注的健康问题,研究开发抗HIV抑制剂具有重要的意义.细胞核因子kB(nuclear factor kappa B,NF-kB)、反... 人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)和获得性免疫缺陷综合症(acquiredimmunodeficiency syndrome,AIDS)仍是全球关注的健康问题,研究开发抗HIV抑制剂具有重要的意义.细胞核因子kB(nuclear factor kappa B,NF-kB)、反式激活因子(trans-activator of transcription,Tat)、病毒颗粒蛋白表达调节因子(regulator of virion protein expression,Rev)是人免疫缺陷病毒I型(human immunodeficiency virustype I,HIV-I)转录过程中不可缺少的调控蛋白.综述NF-kB、Tat、Rev蛋白的结构、功能、作用机理及相关抑制剂的研究进展. 展开更多
关键词 HIV-I 转录 NF-KB REV tat 抑制剂
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RGD-TAT-KDRsiRNA慢病毒载体构建及抗肿瘤活性 被引量:1
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作者 张俭丽 郑旭 王杰 《中国公共卫生》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期594-597,共4页
目的构建精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)介导的穿膜肽(TAT)-血管内皮细胞生长因子受体(KDR)siRNA融合基因慢病毒载体,探讨其对人肺癌A549细胞的抑制效果。方法设计合成编码RGD的2条寡核苷酸链,克隆到p GC/TAT-KDR siRNA载体的TAT下游,构建... 目的构建精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)介导的穿膜肽(TAT)-血管内皮细胞生长因子受体(KDR)siRNA融合基因慢病毒载体,探讨其对人肺癌A549细胞的抑制效果。方法设计合成编码RGD的2条寡核苷酸链,克隆到p GC/TAT-KDR siRNA载体的TAT下游,构建TAT-RGD-KDR siRNA融合基因载体;慢病毒包装并感染A549细胞;通过Western blot和real-time PCR检测A549细胞KDR基因表达水平;通过噻唑蓝法、双色法流式细胞仪和Transwell侵袭实验检测KDR基因沉默对A549细胞凋亡和侵袭力的影响。结果测序和Blast比对证实重组载体中的RGD序列与设计一致;TAT-RGD-KDR siRNA融合基因慢病毒载体转染A540细胞KDR mRNA和蛋白表达水平分别为(22.7±3.9)%和(19.3±2.7)%,明显低于TAT-KDR siRNA融合基因慢病毒载体转染组,差异有统计学意义(P<0.01);该载体具有较强的抑制A549细胞增殖、促进细胞凋亡和抑制细胞体外侵袭力的作用。结论 TAT-RGD-KDR siRNA融合基因慢病毒载体通过抑制细胞KDR mRNA和蛋白表达,抑制A549细胞增殖和侵袭、促进细胞凋亡。 展开更多
关键词 精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD) 穿膜肽(tat) 血管内皮细胞生长因子受体(KDR) tat-RGD-KDR siRNA融合基因 慢病毒载体
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Ⅰ型人免疫缺陷病毒调控蛋白顺式转录激活因子的功能及其与疾病的相关性
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作者 李远航 陈睿鑫(综述) 杜娟(审校) 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第2期227-233,共7页
获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS),又称艾滋病,一直是全球范围内公共卫生关注的重大传染病之一。Ⅰ型人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)是导致AIDS的病原体,即使目前广泛采用... 获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS),又称艾滋病,一直是全球范围内公共卫生关注的重大传染病之一。Ⅰ型人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)是导致AIDS的病原体,即使目前广泛采用的高效抗逆转录病毒疗法(鸡尾酒疗法)可有效抑制HIV-1的感染和复制,感染者依然会罹患其他疾病,如HIV-1相关的神经认知紊乱症(HIV-associated neurocognitive disorder,HAND)。本文主要探讨HIV-1中重要的调控蛋白顺式转录激活因子(trans-activator of transcription,Tat)的功能,以及其与HIV-1复制及HAND的相关性,以明确研发靶向Tat蛋白的抗AIDS药物的重要性。 展开更多
关键词 顺式转录激活因子 Ⅰ型人免疫缺陷病毒 神经认知紊乱症 获得性免疫缺陷综合征
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HIV-1 Tat真核表达载体的构建及在内皮细胞的表达
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作者 史继静 刘朝奇 +2 位作者 杨凡 柳发勇 韩钰 《实用医学进修杂志》 2008年第3期-,共5页
目的:构建HIV-1 Tat真核表达质粒,为研究Tat在HIV-1致病机制中的作用奠定实验基础。方法:以pCV1(tat and rev)质粒为模板,用PCR方法扩增HIV-1 Tat基因,克隆至p cDNA3.1(+)表达载体,酶切及测序鉴定重组体。重组质粒转染ECV304细胞,用RT-... 目的:构建HIV-1 Tat真核表达质粒,为研究Tat在HIV-1致病机制中的作用奠定实验基础。方法:以pCV1(tat and rev)质粒为模板,用PCR方法扩增HIV-1 Tat基因,克隆至p cDNA3.1(+)表达载体,酶切及测序鉴定重组体。重组质粒转染ECV304细胞,用RT-PCR、转染HIV-1 LTR荧光报告基因的方法检测tat基因的表达及活性。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建pcDNA3.1(+)-Tat重组质粒。重组体转染ECV304细胞,建立稳定表达细胞株,应用RT-PCR可检测到Tat基因mRNA的表达;荧光仪检测Tat蛋白可明显促进荧光素酶在ECV304细胞内的表达。结论:成功构建HIV-1Tat真核表达载体,并建立了HIV-1 Tat内皮细胞稳定表达细胞株。 展开更多
关键词 HIV tat基因 真核表达载体 RT-PCR HIV-1 LTR-Luc报告基因
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Review of current progress in the structure and function of Smad proteins 被引量:49
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作者 陈伟 付小兵 盛志勇 《Chinese Medical Journal》 SCIE CAS CSCD 2002年第3期446-450,共5页
PURPOSE: To review the recent developments in the structure and function of Smad proteins. DATA SOURCES: Both Chinese- and English-language literatures were searched using MEDLINE/CD-ROM (1997 - 2000) and the Index of... PURPOSE: To review the recent developments in the structure and function of Smad proteins. DATA SOURCES: Both Chinese- and English-language literatures were searched using MEDLINE/CD-ROM (1997 - 2000) and the Index of Chinese-Language Literature (1997 - 2000). STUDY SELECTION: Data from published articles about TGF-beta signal transduction in recent domestic and foreign literature were selected. DATA EXTRACTION: Data were mainly extracted from 22 articles which are listed in the reference section of this review. RESULTS: Smad proteins mediate signal transduction induced by the TGF-beta superfamily. Based on their structural and functional properties, Smad proteins are divided into three groups. The first group, receptor-regulated Smads (R-Smads), are phosphorylated by activated type I receptors and form heteromeric complexes with the second group of Smads, common mediator Smads (Co-Smads). These Smad complexes translocate into the nucleus to influence gene transcription. Inhibitory Smads (I-Smads) are the third group and these antagonize the activity of R-Smads. In the nucleus, Smads can directly contact Smad-binding elements (SBE) in target gene promoters. Through interaction with different transcription factors, transcriptional co-activators or co-repressors, Smads elicit different effects in various cell types. The aberrance of Smad proteins has been noted in several human disorders such as fibrosis, hypertrophic scarring and cancer. CONCLUSION: The structure of Smads determines their function as transcriptional factors which translocate signals from the cell surface to the nucleus where Smads regulate TGF-beta superfamily-dependent gene expression. 展开更多
关键词 DNA-Binding Proteins Humans Research Support Non-U.S. Gov't Signal Transduction Smad Proteins trans-activators transcription Factors Transforming Growth Factor beta
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调控HIV-1转录和潜伏激活的机制及相关因子(英文) 被引量:1
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作者 Rong-diao LIU Jun WU +1 位作者 Rui SHAO Yu-hua XUE 《Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology)》 SCIE CAS CSCD 2014年第5期455-465,共11页
(1)反式激活蛋白(Tat)是病毒复制的重要因子,正性转录延伸因子b(P-TEFb)是Tat反式激活HIV-1转录所必需的特异性宿主细胞因子,其活性与HIV-1的转录密切相关。(2)在细胞内,无活性7SK snRNP复合体是功能性有活性P-TEFb的贮存和来源。在特... (1)反式激活蛋白(Tat)是病毒复制的重要因子,正性转录延伸因子b(P-TEFb)是Tat反式激活HIV-1转录所必需的特异性宿主细胞因子,其活性与HIV-1的转录密切相关。(2)在细胞内,无活性7SK snRNP复合体是功能性有活性P-TEFb的贮存和来源。在特定条件下,7SK snRNP复合体发生解离并释放出P-TEFb,从而刺激转录延伸。可以说,P-TEFb的活性受到严格的调控,维持着一种动态的平衡。(3)同时,P-TEFb还存在于一个具有超高转录活性的超级延伸复合体(SEC)中。Tat能将含有两个延伸因子P-TEFb和ELL2的SEC复合体募集至HIV-1长末端结构域(LTR),然后众多因子协同作用有效地增强HIV-1的转录作用。(4)溴区包含蛋白4(Brd4)像Tat一样,将P-TEFb募集至众多细胞基因的启动子区域,促进转录。Brd4也可激活基础水平的HIV-1转录,却对依赖Tat的HIV-1转录具有抑制作用,因为Brd4和Tat竞争性地与P-TEFb结合。(5)鉴于Brd4对Tat依赖性HIV-1转录的抑制作用,寻找能够抑制Brd4的小分子药物,激活HIV-1潜伏,结合高效抗逆转录病毒治疗(HAART),使得彻底根除HIV-1变成可能。Brd4的抑制剂JQ1就是这样的一种小分子,并且已被证明可以在多种细胞模型中激活HIV-1潜伏。 展开更多
关键词 人类免疫缺陷病毒(HIV-1) 转录延伸 RNA聚合酶Ⅱ tat P—TEFb
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On the structure of AP-4 responsive element in the LTR of Jembrana disease virus
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作者 Zijing Liu Hongyan Yin +4 位作者 Gang Deng Yuhua Yuan Jinzhong Wang Yunqi Geng Qimin Chen 《Chinese Science Bulletin》 SCIE EI CAS 2003年第12期1247-1250,共4页
Previous studies with deletion and sequence analysis of JDV LTR showed that there is a putative AP-4 responsive element in LTR. By antisense transient assay and gel shifting assay, we for the first time demonstrated t... Previous studies with deletion and sequence analysis of JDV LTR showed that there is a putative AP-4 responsive element in LTR. By antisense transient assay and gel shifting assay, we for the first time demonstrated that AP-4 modulated JDV gene expression by binding DNA di-rectly to bovine cells. The results, derived from site-directed mutagenesis experiments, suggest that the six base pairs of AP-4 binding site (CAGCTG) have different effects on JDV gene expression. When the first two base pairs changed to GC, JDV gene expression is severely decreased. 展开更多
关键词 JDV cellular factor AP-4 trans-activator (tat) LTR SITE-DIRECTED mutagenesis.
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