Multiple transgenes Populus xeuramericana 'Guariento' plants obtained by biolistic bombardment

A JERF36 regulation gene, a selection marker gene (NPT-II), and the foreign genes levansucrase (SacB), Vitreoscilla hemoglobin (vgb), and Binary coleopterus insect resistance (BtCry3A+OC-I) were co-transferred into Populus xeuramericana 'Guariento' using biolistic bombardment; 25 kanamycin resistant plants were obtained. The results of PCR and Southern hybridization showed that the foreign genes had been integrated into the genome of P. xeuramericana 'Guariento' and 5 genes were all transferred into 7 poplar plants. The results of a BtCry3A ELISA experiment indicated that the BtCry3A gene was expressed in the 7 transgenic poplar plants, and these plants grew well on coastal saline land.

盐胁迫对转AtNHX1基因杨树光合特性与叶绿体超微结构的影响

以欧美107杨(Populus×euramericana‘Neva’,Wt)和转拟南芥液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因At-NHX1的欧美107杨新品系(Tr)幼苗为材料,研究了高低度盐胁迫对两品系幼苗光合色素含量、光合参数和叶绿体超微结构的影响,以阐明转AtNHX1基因杨树的耐盐性与其光合作用及叶绿体结构之间的关系。结果表明:(1)盐处理后,两品系叶片叶绿素含量、类胡萝卜素含量、净光合速率、蒸腾速率和气孔导度均下降,且高盐度处理下降幅度更大;同等盐度处理下,Tr品系叶片叶绿素含量、净光合速率和气孔导度的下降幅度显著低于Wt品系,且在高盐度处理间差异更大;两品系杨树叶片Pn下降的原因在低盐处理时以气孔限制为主,而在高盐下则是气孔限制和非气孔限制共同作用的结果。(2)盐胁迫对Tr品系叶片叶绿体超微结构的影响较轻,其在高盐下仍保持了较好的内部结构;盐胁迫Wt品系叶绿体则缩皱成球形,内部结构趋向简单,以至解体,脂质球显著增多。可见,盐胁迫导致杨树叶绿体结构破坏而引起叶绿体色素含量下降,最终降低其光合作用效率;同等盐度胁迫下,转At-NHX1基因品系叶片保持了较完整的叶绿体超微结构、更高的叶绿素含量,能维持较好的光合状态,从而表现出较高的耐盐能力。

转AtNHX1基因杨树Tr品系的耐盐性研究

以不同盐分强度处理欧美107杨(Populus×euramericana‘Neva’)(Wt)和转拟南芥液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因AtNHX1欧美107杨新品系(Tr)幼苗,揭示Tr和Wt两品系幼苗耐盐性的差异,探索拟南芥液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因AtNHX1对提高杨树耐盐能力的效应。结果表明:低盐处理下,Wt植株生长明显受到抑制,其干重显著低于对照,盐分强度加大后,抑制作用更大,其干重只有对照的50%;而Tr植株在低盐处理下干重与对照差异不显著,高盐处理时其干重为对照的74%。同时,不同盐度处理下,Tr的干重均显著高于Wt,且随着盐度升高,两品系间植株干重差异增大。盐处理后,Tr植株叶片叶绿素和类胡萝卜素的含量均显著高于Wt,并能维持较高的净光合速率(Pn)和PSII最大光化学效率(Fv/Fm);在盐处理下虽然Tr叶片和根系均较Wt积累了更多的Na+,但同时也维持了更高的K+和K+/Na+比率,而且叶片对K+选择性的运输明显高于Wt;同时,Tr叶片MDA含量和电解质渗漏率显著低于Wt。可见,在盐处理下转AtNHX1植株较未转基因植株维持了更高的生长量、光合色素、光合能力和叶片质膜稳定性,说明AtNHX1的转入能够显著提高欧美107杨的耐盐性。

外生菌根菌和植物生长物质复合制剂对杨树扦插苗生长及抗逆性的效应

通过扦插试验研究了由植物生长物质和树木菌根菌组成的复合制剂对108杨扦插苗成活率、苗高、地径、根茎 比、菌根侵染率、毛根数、生物量、树体电容、叶绿素含量以及抗病性相关酶活性等指标的影响。发现复合制剂可以 促进苗木的根系生长,苗木根系的毛根数、菌根侵染率及根茎比指标较对照有显著提高;可以促进苗木地上部分的 生长发育,成活率、苗高、地径、生物量、叶绿素含量、长势等指标较对照均有显著提高;可以提高苗木的抗病能力,苗 木的树皮相对膨胀度、过氧化物酶活性、多酚氧化酶活性及苯丙氨酸解氨酶活性较对照均有显著提高。经IBA溶液 浸泡处理亦可有效提高苗木的生长,但整体效果不及复合制剂的最佳处理。初步确定了复合制剂的最有效成分配 比及处理方法。

豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因转化欧美杨的研究

本研究建立了欧美107杨的高频再生体系,用改良的根癌农杆菌介导法将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入107杨中。经过严格的卡那霉素(Km)筛选,得到了Km抗性(Kmr)植株。对部分Kmr植株进行PCR及PCR-Southern杂交鉴定,证实CpTI基因已整合进杨树基因组中。转基因植株的饲虫实验表明,其中部分株系的叶片可在一定程度上抑制扁刺蛾幼虫的生长。

美洲黑杨杂种优良无性系转抗虫基因(Bt和CpTI)的研究

以美洲黑杨杂种优良无性系南林895杨(Populus×euramericanac‘v.Nanlin895’)为转基因受体材料,以嫩芽或腋芽为外植体材料组织培养再生植株,利用农杆菌介导法转化Bt基因和CpTI基因。结果显示较合适的组培再生与遗传转化系统为:叶分化培养基为MS+6-BA0.5mg/L+TDZ0.002mg/L,芽伸长培养基为MS+6-BA0.2mg/L+TDZ0.001mg/L+Km10mg/L+Carb500mg/L,生根培养基为1/2MS;预培养3d,菌液浓度OD6001.0～1.3左右,侵染时间20min,共培养4d,叶盘转化频率可达28.7%。对Kmr植株经PCR分析,筛选获得了18株整合有Bt基因和1株整合有CpTI基因的转基因植株。部分转基因植株的初步饲虫实验表明,饲喂转基因杨树叶片可明显抑制杨小舟蛾的生长发育。

转基因库安托杨对根际土壤微生物及酶活性的影响

对4年生转基因库安托杨在生长过程中的土壤微生物和酶活性变化情况进行调查,发现转基因与非转基因株系的3大类根际微生物数量和蛋白酶活性分别表现为"增→减→增→减"和"减→增→减"的倒"S"型变化趋势,土壤脲酶、磷酸酶酶活性的变化趋势均呈"增→减"的倒"V"字型的变化趋势,且转基因库安托杨基本未对微生物数量和酶活性产生显著影响。

转多基因库安托杨对昆虫群落的影响

为了解转多基因库安托杨在自然生态系统下的生态安全性,于2011-2012年杨树主要生长季节,采用定点取样法对湖南君山地区转多基因库安托杨林昆虫物种多样性进行调查,对主要靶标昆虫云斑天牛(Batocera horsfieldi)在6个调查系号中的数量分布进行比较。结果表明,初步统计转多基因库安托杨混合林内昆虫80种,隶属于7目32科,其中害虫55种,杨扁角叶蜂(Stauronema tuscompressicornis)、杨小舟蛾(Micromelalopha trogldyta)、柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)和云斑天牛为优势种群;转多基因杨树在一定程度上能降低鞘翅目害虫的种群数量,但对云斑天牛的抗虫性与对照杨和本地杨比较差异性不明显(PCK=0.366>0.05和PXL=0.391>0.05);通过比较各调查样区昆虫群落多样性发现,转多基因杨树林无论是群落多样性指数、优势度还是均匀度系数,均与对照区和本地种杨树林差异性不显著(PCK=0.247>0.05和PXL=0.458>0.05)。

108杨叶片再生体系的建立

[目的]研究欧美杨108离体叶片再生技术,为遗传转化研究提供科学依据。[方法]研究了外植体的消毒方法和不同激素组合对叶片再生和不定芽生根的诱导效果。[结果]茎段外植体消毒的最佳处理为:75%乙醇溶液消毒10s+0.1%升汞消毒10min,污染率和褐化率均低,成活率较高;叶片诱导分化培养基以MS+6-BA0.6mg/L+NAA0.2mg/L效果最好,诱导率100%,平均不定芽诱导数为26.43个;最佳生根培养基为1/2MS+IBA0.3mg/L或1/2MS+IAA0.3mg/L,生根率可达100%,生根数分别为4.83条和5.20条。[结论]以108杨叶片为外植体,建立了108杨的高效再生体系。

新品种欧美杨107和108引种特性研究

研究了新品种欧美杨107,108引种到新乡地区后,其物候期、定植成活率及苗木生长情况。结果表明:欧美杨107比对照中林46萌芽期早,落叶期晚,年生长天数多15~45d;欧美杨107,108定植成活率都在92%以上,最高达到99.5%;二者都比对照生长速度快;同等管理条件下,在不同土壤质地中,砂壤土地的欧美杨107生长优于粘土和两合土;在不同土壤类型中,潮土地的欧美杨107生长优于棕壤土和褐土。

欧美杨108组培苗最佳移栽基质试验

以欧美杨108已生根无菌苗为材料,选用土壤与蛭石为原料,土壤与蛭石体积比为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1,研究了欧美杨108组培苗最佳移栽基质。结果表明:土壤与蛭石比为1∶1的处理成活率达到91.7%,植株的平均高度最高,生长状况最好,而且其生长速度最快。研究表明,开始移栽时的组培苗生长状况、组培苗苗龄、移栽温度、移栽基质以及移栽方式等是影响欧美杨108组培苗移栽成活率的主要因素。

卡那霉素对108杨不定芽诱导的影响

以108杨为试材,以茎段、叶柄、叶片3种外植体的高效不定芽诱导再生为基础,研究了不同梯度浓度卡那霉素(Km)对108杨不定芽诱导的影响。结果表明:茎段外植体对Km表现出较高的耐受性,叶柄和叶片外植体的敏感性高;在遗传转化过程中70mg/L的Km作为茎段外植体的临界筛选浓度较为合适;对于叶柄和叶片外植体,选择30mg/L的Km临界筛选浓度较为合适。

‘欧美杨108’组培苗最佳移栽条件研究

‘欧美杨108’组织培养技术已见成效,但其移栽技术还不完善,成活率比较低,社会上对其移栽基质的研究很少。以‘欧美杨108’已生根无菌苗为材料,选用土壤与蛭石为原料,土壤与蛭石体积比分别为1:1、1:2、1:3、2:1。经试验可知:土壤与蛭石比为1:1的处理成活率达到91.7%,植株的平均高度最高,生长状况最好,且生长速度最快。

盐胁迫条件下转多基因库安托杨根尖离子流变化

【目的】细胞质内K+/Na+平衡对细胞的代谢起重要作用,同时也被认为是植物抵御盐胁迫的重要部分。【方法】以转多基因库安托杨株系D5-21、D5-20及非转基因受体D5-0为材料,研究100 mmol·L-1Na Cl处理的不同时期(7,15,30天)各杨树株系的株高、根部干物质量、根尖离子流(Na+、K+、H+)的动态变化(利用非损伤微测技术)。【结果】生长数据表明:与正常供水条件相比,7天盐胁迫处理后,3个株系的株高降低,但不显著;15天处理后,D5-20,D5-0株高显著降低;30天处理后,3个株系株高和根部干物质量均显著降低,D5-0,D5-21的根干物质量只有正常供水条件下的一半,说明盐胁迫严重抑制杨树根的生长;但表型变化表明盐胁迫下D5-21,D5-20植株的受害程度更小,并且株高和根部干物质量均高于D5-0。Na+流测定结果表明:7天盐胁迫处理后,各株系根尖的Na+流虽与对照相比有显著变化,但变化幅度均较小;15天盐胁迫处理后,D5-21,D5-20根尖Na+外排能力均是D5-0的1.8倍;30天处理后,D5-21,D5-20根尖Na+外排能力均是D5-0的1.6倍。K+流测定结果表明:D5-0,D5-21根尖K+外流流速随着胁迫时间延长而增大,D5-20则是先增大后减小,但3个株系变化趋势差异较大,30天处理时,D5-0的流速已是D5-21,D5-20的1.7倍和2.1倍。H+流测定结果表明:虽然与D5-21,D5-20一样,D5-0的H+内流值随着胁迫时间延长而增大,但D5-21,D5-20的增幅明显大于D5-0,30天处理时,二者的H+流速是D5-0的1.6倍和1.2倍。因此,不论是短期(7天)、中期(15天)还是长期(30天)盐胁迫处理,与非转基因株系相比,转基因株系D5-21,D5-20都具有更强的Na+外排和H+内流能力,且K+的外流幅度远低于D5-0,说明转基因株系可通过将根尖细胞质中过多的Na+主动外排、并减少根尖细胞中K+的损失,维持胞质中的适宜的K+/Na+,转基因株系的耐盐性提高,从而有利于转基因株系的生长积累,这将为转基因林木的耐盐性筛选提供新的参考依据。【结论】JERF36基因属于ERF类转录因子,它可激活植物中下游抗逆相关基因的表达,与植物的抗逆性密切相关,因此未来可研究盐胁迫下转多基因库安托杨中JERF36基因与Na+,K+,H+这3种重要离子的转运所涉及的相关基因表达的关系。

盐胁迫下转复合多基因欧美杨107杨幼苗生长及生理响应

【目的】通过观测转复合多基因欧美杨107杨(转基因107杨)幼苗在不同浓度盐胁迫下生长性状,质膜透性、光合作用等各项指标,以及外源基因表达产物积累量的变化,综合评价转复合多基因杨树在盐胁迫下的适应能力。【方法】以转化成功且已经过验证的转基因107杨为试验材料,未转基因107杨为对照(CK),进行组培扩繁,在幼苗株高10 cm时定植在花盆中,置于人工气候室中培养。分别用0、3、6 g·L^(-1)的Na Cl溶液进行盐胁迫处理,胁迫25天后观测2个株系幼苗的生长指标、生理参数变化,以及甜菜碱与Bt毒蛋白的积累量。【结果】2个株系的生长指标观测结果表明:在低盐浓度处理下,转基因107杨幼苗株高增长量显著高于非转基因对照,转基因株系幼苗地径增长量与对照差异不显著;高盐浓度处理下,2个株系幼苗株高与地径均受到盐胁迫的显著影响。2个株系的生理参数观测结果表明:在低盐浓度处理下,转基因107杨幼苗质膜透性显著低于对照107杨,叶绿素含量有一定程度的增加,净光合速率与蒸腾速率显著高于对照,光系统Ⅱ实际光合效率Y(Ⅱ)小幅度降低但显著高于对照,光系统Ⅱ能够保持较高的电子传递速率;F_v/F_m增幅较高,具有较大光合作用潜力。在高盐浓度下,转基因株系幼苗叶绿素含量降幅较小,而质膜透性、净光合速率均显著降低,F_v/F_m、Y(Ⅱ)均呈现较大幅度下降,光系统Ⅱ电子传递速率受到较大影响,光合能力下降,变化趋势与对照相同,2个株系幼苗均受到较大程度的盐害。转基因株系中外源基因表达产物积累量的ELISA研究结果表明,随盐浓度的增加,Cry1Ac毒蛋白、Cry3A毒蛋白及甜菜碱含量都呈现增加趋势;在高盐浓度胁迫下外源基因产物积累量均显著增加。【结论】转基因107杨在低浓度盐胁迫下表现出良好的适应性,耐盐性优于对照107杨。在高浓度盐胁迫下转基因株系与对照107杨均受到较大影响,转基因株系并未显示其优势。盐胁迫可以诱导外源Bt基因、BADH基因表达加强,盐胁迫下转基因107杨表现出良好的耐盐和抗虫潜力。

利用PMI选择标记进行杨树转基因体系的研究

[目的]利用不同于抗生素的PMI为选择标记基因的遗传转化体系,对杨树进行双抗虫基因(Bt和Cp TI)的转基因研究。建立杨树以PMI为安全标记基因的转基因体系,为安全、高效的林木转基因育种研究提供实验依据。[方法]选择已有的转Cp TI抗虫基因(利用Kmr选择标记获得)的美洲黑杨杂种优良无性系南林895杨(Populus×euramericana‘Nanlin895’)为受体材料,对杨树叶片、叶片分化芽、茎段生根的甘露糖敏感性等筛选优化,采用农杆菌介导的方法进行双抗虫基因的研究。[结果]较为适合的杨树叶片筛选培养基为:甘露糖8 g·L^(-1)和蔗糖22 g·L^(-1);叶片分化芽筛选培养基为:甘露糖10 g·L^(-1)和蔗糖20 g·L^(-1);茎段生根筛选培养基:甘露糖8 g·L^(-1)和蔗糖22 g·L^(-1)。在此基础上,获得了转Bt和Cp TI双抗虫基因的植株8株。[结论]初步建立了以PMI为安全标记基因的杨树转基因体系:确定了PMI筛选的最适选择压,成功构建了含PMI选择标记基因的植物抗虫表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化最终获得了转双抗虫基因植株。