牛α-sl酪蛋白基因序列指导htPA突变体小基因在小鼠乳腺中的表达

将包括α－ｓｌ酪蛋白基因的启动子、ＬＡｔＰＡ小基因、α－ｓｌ酪蛋白基因下游调控序列的融合基 因经显微注射至小鼠的受精卵中，获得了５只转基因阳性鼠，其中１只转基因阳性雌鼠乳清中 ＬＡｔＰＡ的含量为０．１８μｇ／ｍｌ，说明构建的ＬＡｔＰＡ小基因能够正确表达出有生物活性的ＬＡｔＰＡ， 并且可在酪蛋白基因调控序列的指导下在小鼠的乳汁中表达。

小鼠输精管内转染法建立人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)乳腺定位表达生物反应器的研究

外源基因受精卵内显微注射目前仍然是种常用的建立转基因动物的方法,但此方法操作复杂,成本高。因此利用精子作为载体将外源基因带入卵细胞内建立转基因动物成了极具吸引力的方法,并且已有一些成功的报道。虽然该方法简单,但总体来说可重复性较差。我们在建立乳腺定位表达人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)小鼠模型中,对此方法做了改进,即将脂质体包裹的外源基因在小鼠输精管及附睾管内转染精子,而非以往的在体外转染,结果:(1)五只转染小鼠,术后10天内共使10只正常母鼠受精;(2)共繁殖出79只首建者小鼠,存活42只;(3)用PCR检测首建者小鼠外源基因的整合,阳性率为7/42(16.67%);(4)用凝胶平板溶圈试验检测5只PCR阳性的雌性首建者小鼠泌乳期乳汁中的活性tPA,3/5表达,表达量在12—20IU/ml之间(约相当于48—80ng/ml);(5)PCR检测4只子一代小鼠外源基因的遗传情况,阳性率为2/4。

BLG-LAtPA和鼠WAP共注射提高LAtPA在转基因小鼠乳腺中的表达水平

为了提高长效组织纤溶酶原激活剂 (LAtPA)在转基因小鼠乳腺中的表达水平 ,将受控于羊 β 乳球蛋白(BLG)的LAtPA表达载体BLG LAtPA与小鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因片段进行共注射 ,采用此方法建立的转基因小鼠 ,经PCR筛选和Southern印迹鉴定 ,获得 3只LAtPA和WAP共整合阳性鼠 ,并在阳性母鼠乳汁中检测到有溶纤活性的LAtPA表达 ,表达水平达到 10 μg/mL。

组织纤溶酶原激活剂突变体在转基因小鼠乳腺中的表达

组织纤溶酶原激活剂（ｔＰＡ）是一种较理想的溶血栓药物，本研究采用其突变体———长效组织纤溶酶原激活剂（ＬＡｔＰＡ）的ｃＤＮＡ作为目的基因，将它插入羊β乳球蛋白（ＢＬＧ）基因起始密码之前，使ＬＡｔＰＡ的转录、翻译受控于ＢＬＧ基因的５′、３′序列，再将所构建的ＢＬＧＬＡｔＰＡ用显微注射方法建立转基因鼠，经点杂交筛选和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹鉴定，获得２只ＬＡｔＰＡ基因整合阳性鼠，并在阳性母鼠乳汁中检测到有溶纤活性的ＬＡｔＰＡ表达，表达水平１５μｇ／ｍｌ。在这两只转基因鼠的９只Ｆ１代子鼠中，有５只是阳性的，ｔＰＡ表达水平维持在１～２μｇ／ｍｌ，ＢＬＧｔＰＡ融合基因整合到小鼠基因组，能稳定地遗传给子代。