siRNA介导的家蚕ABC转运蛋白相关基因的干涉研究

由siRNA(smallinterferingRNA)介导的RNAi作为一种工具已被广泛用于基因功能研究中,并有望应用于生物体疾病的防治方面。通过显微注射,在家蚕中以siRNA介导的方式,对家蚕ABC转运蛋白(ATPbindingcassettetransporter)系列相关基因(Bmwh1,Bmwh2,Bmwh3)进行了siRNA干涉研究,在部分基因中得到了高效特异的干涉现象。结果初步证实正义链3′碱基错配的siRNA也具有显著的干涉效果。实验还显示了siRNA较之于dsRNA介导的RNAi更具有优势,表明siRNA介导的RNAi可作为基因功能分析和未来的基因操作手段在家蚕的研究中应用。

钙转运蛋白基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的:构建针对钙转运蛋白(CaT1)特异性干扰RNA(siRNA)及其表达载体,并检测其对CaT1基因的干扰作用。方法:设计CaT1靶向的发夹状siRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSilencer3·1-H1载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体转染法转染人类胃癌细胞BGC,通过RT-PCR检测CaT1基因表达水平的变化。结果:酶切鉴定与DNA测序分析证明CaT1基因的siRNA载体构建正确,RT-PCR结果表明CaT1基因的表达水平明显降低。结论:成功地构建了针对CaT1基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制CaT1基因表达。

siRNA干扰VNUT基因对INS-1胰岛素分泌的影响

目的观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰囊泡膜核苷酸转运体(vesicular nucleotide transporter,VNUT)基因对大鼠胰腺β细胞(INS-1)胰岛素分泌的影响。方法2021年1月至6月通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白印迹和酶联免疫吸附剂测定(ELISA)等方法检测siRNA对VNUT基因表达的作用以及对胰岛素分泌的影响。采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果siRNA转染INS-1细胞24 h后,VNUT基因表达明显下降,对照组和干扰组RNA表达结果分别为(0.452±0.218)和(0.319±0.116),蛋白分别为(0.514±0.297)和(0.369±0.203),差异均有统计学意义(均P<0.05);胰岛素分泌明显抑制,对照组和干扰组结果为(281.45±24.92)ng/L和(176.54±15.70)ng/L,差异有统计学意义(P<0.05)。结论siRNA明显抑制VNUT基因表达与INS-1胰岛素分泌,深入研究VNUT基因对胰岛素分泌的影响可为2型糖尿病发病机制因素提供参考资料。

化学治疗联合靶向COX-2 siRNA对大鼠胃癌组织JAM-1、E-cadherin及β-catenin蛋白表达的影响

目的探讨化学治疗联合靶向环氧合酶-2(COX-2)siRNA对大鼠胃癌组织连接附着分子1(JAM-1)、E钙黏素(E-cadherin)及β-连环素(β-catenin)蛋白表达的影响。方法 45只健康SD大鼠按照随机数字表法分为观察组、阴性对照组和对照组,每组各15只。观察组采用化学治疗联合COX-2siRNA转染的胃癌细胞接种干预,阴性对照组采用化学治疗联合阴性siRNA转染的胃癌细胞接种干预,对照组采用未经siRNA转染的胃癌细胞接种干预,比较3组大鼠胃癌组织的COX-2、JAM-1、E-cadherin及β-catenin蛋白表达水平。结果经COX-2siRNA转染的胃癌SGC7901细胞凋亡率显著高于阴性siRNA转染组(P=0.000)和未经转染的SGC7901组(P=0.000);观察组大鼠肿瘤体积抑制率[(75.8±5.4)%]显著高于阴性对照组[(11.9±4.7)%](P=0.000);观察组COX-2蛋白表达显著低于阴性对照组(P=0.000)和对照组(P=0.000);观察组大鼠肿瘤组织JAM-1、E-cadherin及β-catenin蛋白表达阳性率显著高于阴性对照组和对照组(P<0.05)。结论化学治疗联合靶向COX-2siRNA可有效抑制大鼠胃癌组织中的COX-2蛋白表达,从而抑制肿瘤组织侵袭转移相关黏附分子JAM-1、E-cadherin、β-catenin蛋白表达,提高治疗效果。

L-精氨酸转运体-2的siRNA表达载体的构建及鉴定

目的:构建氨基酸转运体-2(CAT-2)的靶向小分子干扰RNA(siRNA)表达载体质粒,并测序鉴定,为下一步研究靶向siRNA对CAT-2蛋白表达和L-argine/iNOS/NO通路的影响建立基础。方法:根据L-精氨酸转运体CAT-2的mRNA序列及siRNA设计原则,并经BLAST比对,设计合成4对siRNA寡聚单链DNA,退火成双链dsDNA,用载体构建试剂盒BLOCK-iTTMPol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP进行重组质粒构建,将4对dsDNA分别插入到siRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4个siRNA表达质粒,并转化至感受态细菌DH5。筛选阳性克隆并提取重组质粒后测序分析。结果:CAT-2的siRNA重组载体质粒测序结果证实表达载体构建成功。结论:L-精氨酸转运体CAT-2 siRNA表达载体质粒成功构建,为下一步研究靶向siRNA对CAT-2蛋白表达和L-arg/iNOS/NO通路的影响建立基础。

ATP7B siRNA阳离子纳米脂质体逆转卵巢癌细胞株顺铂耐药的体内外实验研究

目的:探讨负载P型铜转运ATP酶(ATP7B)、小干扰RNA(siRNA)阳离子纳米脂质体(ATP7B/DC-Lip)逆转卵巢癌细胞株SKOV3顺铂(DDP)耐药的作用及意义。方法:通过DDP梯度诱导法构建卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP,利用细胞增殖抑制实验测定其耐药指数。薄膜分散法制备ATP7B/DC-Lip并测定其各项纳米表征。利用细胞增殖抑制实验和裸鼠体内实验分别检测ATP7B/DC-Lip的体内外抗肿瘤效果。结果:成功构建了卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP,ATP7B/DC-Lip在体外条件下可以分别沉默75%(48小时)和78%(72小时)的ATP7B蛋白表达。在体内外抑制肿瘤生长实验的结果显示,当转染ATP7B/DC-Lip后,体外条件下SK-OV3/DDP的IC50显著下降为3.51±0.93μg/ml(n=6);体内DDP耐药型肿瘤模型中DDP+ATP7B/DC-Lip组的肿瘤大小较其他组明显更小(P<0.05)。结论:ATP7B/DC-Lip可以逆转卵巢癌细胞株SKOV3的DDP耐药,可能作为一种有效的纳米药物用于治疗DDP耐药性卵巢癌。

靶向抑制GLUT1对糖尿病视网膜病变中视锥细胞的保护作用

目的观察抑制视网膜上葡萄糖转运蛋白-1(glucose transporter-1,GLUT1)对糖尿病视网膜病变中视锥细胞的影响。方法 27只8周龄C57BL/6小鼠按随机数字表法分为正常对照组、糖尿病对照组和GLUT1小干扰核糖核酸(siRNA)治疗组。腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型后,GLUT1 siRNA治疗组予以玻璃体腔注射靶向GLUT1的siRNA,正常对照组和糖尿病对照组注射等量非靶向性siRNA,以上操作每2周重复注射1次,共注射9次。建模第18周3组小鼠行明适应视网膜电图检查视锥细胞功能,免疫荧光共定位法和免疫印迹法检查视网膜GLUT1的表达,测定比较视网膜含糖量,通过免疫荧光共定位法检查视锥细胞的密度及形态改变。结果与糖尿病对照组相比,GLUT1 siRNA治疗组小鼠视网膜GLUT1表达明显下调,较正常对照组下降68.51%(P<0.01)。尽管糖尿病对照组和GLUT1 siRNA治疗组视网膜组织含糖量均高于正常对照组,但GLUT1 siRNA治疗组小鼠视网膜含糖量比糖尿病对照组低42.67%,差异有统计学意义(P<0.01);糖尿病对照组和GLUT1 siRNA治疗组小鼠的明适应视网膜电图的a波及b波振幅均低于正常对照组,但GLUT1 siRNA治疗组较糖尿病对照组分别高47.59%和42.61%,差异有统计学意义(P<0.01);形态学检查发现糖尿病对照组较GLUT1 siRNA组视锥细胞排列稀疏,外节形态更为短小。结论 GLUT1 siRNA通过抑制GLUT1表达,限制转运葡萄糖进入视网膜,降低视网膜局部含糖量从而对光感受器视锥细胞产生保护作用。

阳离子脂质体DLin-MC3-DMA合成

可电离的阳离子脂质体DLin-MC3-DMA是一种高效的siRNA运输载体,它能有效封装相应的siRNA并使其进入细胞质内,然后两者分离,siRNA发挥其功效。以价格低廉的亚油酸为起始原料,经还原、溴代、格氏和缩合等4步反应,高效合成了目标化合物DLin-MC3-DMA,不仅缩短了反应步骤,而且有效降低了成本。

传输靶向COX-2 siRNA联合化疗药物对大鼠胃癌细胞生长的抑制作用

目的:通过动物实验探讨传输靶向COX-2siRNA联合化疗药物对大鼠胃癌细胞生长的抑制作用。方法:24只健康SD大鼠平分为三组,治疗组用COX-2-siRNA转染的胃癌SGC7901细胞接种,同时进行环磷酰胺、丝裂霉素C化疗治疗;阴性对照组,用阴性对照siRNA转染的胃癌SGC7901细胞接种,同时进行环磷酰胺、丝裂霉素C化疗治疗;对照组(n=8),用未经转染的胃癌SGC7901细胞接种,不进行化疗治疗;三组转染后都接种了裸鼠。结果:治疗组、阴性对照组及对照组胃癌细胞凋亡率分别为(22.28±0.12)%、(1.23±0.17)%和(1.03±0.14)%,治疗组与阴性对照组和对照组比较差异都有统计学意义(t=18.152,17.555,P<0.05)。治疗组的抑瘤率为76.7%,阴性对照组和对照组分别为12.8%和6.89%,治疗组的抑瘤率明显高于其他两组(x2=15.211,13.899,P<0.05)。Western blotting检测结果显示治疗组的COX-2蛋白表达含量得到了明显抑制。结论:传输靶向COX-2siRNA和化疗药物的配合应用可有效抑制COX-2蛋白的表达,从而抑制胃癌细胞的生长,从而起到更好的治疗效果。

RNA分子在植物韧皮部长距离运输的研究进展

RNA分子存在于植物韧皮部筛分子中,且能进行长距离运输,这是植物界一个突破性的发现。现已发现有3类RNA存在于韧皮液内,包括外源类病毒或RNA病毒,植物内源mRNA和非编码小RNA。韧皮液内RNA分子的长距离移动可作为系统信号分子介导植物生长发育的调控。本文就韧皮液的取样方法,韧皮液内存在的RNA分子及其介导的信号调控和运输机制等进行了综述。

沉默MagT1影响大鼠心肌细胞内Mg^(2+)水平和细胞凋亡的研究

目的使用siRNA沉默大鼠心肌细胞的镁离子转运蛋白1(MagT1),检测细胞内Mg^(2+)浓度变化和细胞凋亡情况。方法设计并合成MagT1siRNA序列,转入原代培养大鼠心肌细胞沉默MagT1,使用反转录PCR和Western blot检测MagT1mRNA和蛋白表达情况,荧光显微镜检测细胞内Mg^(2+)浓度变化情况,流式细胞法检测细胞凋亡情况。结果相比阴性siRNA组,MagT1siRNA转染大鼠心肌细胞48h,MagT1mRNA的沉默效率为51.83%(P<0.05),MagT1蛋白的沉默效率为56.75%(P<0.05),胞内Mg^(2+)浓度降低29.13%(P<0.05),细胞凋亡率为31.18%(P<0.01);转染60h,MagT1mRNA的沉默效率为86.91%(P<0.01),MagT1蛋白质的沉默效率为83.85%(P<0.01),细胞内Mg^(2+)浓度降低41.32%(P<0.01),细胞凋亡率为40.61%(P<0.01)。结论 MagT1被显著沉默后,细胞内Mg^(2+)浓度显著降低,细胞凋亡显著提高,细胞生命活动受到较大影响。