蛋氨酸二肽对Transwell小室培养的奶牛乳腺上皮细胞中乳蛋白合成的影响

为明确奶牛乳腺中小肽的吸收和利用机制,本试验研究了蛋氨酸二肽(Met-Met)在Transwell小室培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)中的摄取及其对乳蛋白合成的影响。首先将BMECs培养在Transwell小室中,待BMECs形成细胞层后,分别在Transwell上室和下室培养液中添加0.5 mmol/L的Met-Met,以不添加Met-Met作为对照。培养24 h后,收集BMECs,采用Western blot检测β-酪蛋白(β-casein)和小肽转运载体2(PepT2)蛋白的相对表达量以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)和蛋白激酶B(AKT)的磷酸化水平。结果显示:BMECs在Transwell小室中培养6 d后,细胞层跨膜电阻达到平台期,反映细胞层紧密性良好;Transwell上室和下室培养液中添加Met-Met显著增加了BMECs中β-casein和PepT2的蛋白相对表达量(P<0.05);Transwell下室培养液中添加Met-Met显著提高了mTOR、S6K1和AKT蛋白的磷酸化水平(P<0.05)。以上结果表明,Transwell上室和下室培养液中的Met-Met均可被BMECs摄取用于乳蛋白的合成,PepT2在BMECs基底膜小肽吸收和顶膜小肽重吸收过程中发挥重要作用,基底膜Met-Met通过激活mTOR和AKT信号通路促进乳蛋白的合成。

Transwell小室共培养条件下缺氧时视网膜色素上皮细胞对内皮细胞增殖的影响

目的研究在Transwell小室共培养系统中,缺氧时视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)对血管内皮细胞增殖的影响。方法培养并鉴定RPE细胞和人脐静脉血管内皮细胞,利用200μmol/LCoCl2造成细胞缺氧、Transwell小室建立细胞共培养模型。实验分为4组:对照组:内皮细胞;共培养组:内皮细胞+RPE细胞;缺氧对照组:内皮细胞+CoCl2;缺氧共培养组:内皮细胞+RPE细胞+CoCl2,各组分别培养0 h2、4 h4、8 h后,应用MTT法检测内皮细胞增殖情况。结果常氧时,对照组内皮细胞光吸收值(A值)在24 h达最高;对照组和共培养组内皮细胞光吸收值在各时间点差别均无统计学意义(P>0.05)。缺氧条件下,缺氧对照组A值在24 h4、8 h均低于对照组(P<0.05);缺氧对照组A值在24 h、48 h低于缺氧共培养组(P<0.05)。结论缺氧早期内皮细胞增殖受到抑制;缺氧条件下,RPE促进内皮细胞的增殖。

Transwell小室环境下兔成骨样细胞与骨髓基质干细胞的共培养及成骨分化

背景:以往在体外采用地塞米松、生长因子或用成骨样细胞与骨髓间充质干细胞按1∶1混合培养诱导成骨均存在种种局限。目的:观察在 Transwell小室环境下成骨样细胞与骨髓基质干细胞体外共培养及成骨样细胞定向诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的可行性。方法:取第 3代乳兔成骨样细胞与第3代兔骨髓基质干细胞接种共培养于Transwell小室内,成骨样细胞接种于培养板底层,骨髓基质干细胞接种于 Transwell膜内膜上作为实验组。以骨髓基质干细胞单独接种于Transwell 小室内,下层为基础培养液作为对照组。结果与结论:实验组共培养骨髓基质干细胞明显向成骨细胞分化,细胞碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P < 0.05)。实验组骨髓基质干细胞茜素红染色强阳性,可见呈红色结节,经PT-PCR扩增后,可见成骨启动基因核心结合因子α1的表达;对照组未见矿化结节。说明应用Transwell小室可实现成骨样细胞与骨髓基质干细胞体外共培养,并能定向诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化。

在Transwell小室中分离培养人脐静脉内皮细胞的研究

目的建立一种在特殊材料Transwell培养小室中分离培养原代人脐静脉内皮细胞的技术。方法采用酶消化法分离得到人脐静脉内皮细胞(HUVEC),免疫荧光法检测内皮因子Ⅷ予以鉴定,待长满后用不含EDTA的0.25%胰酶传代到Transwell小室中,观察小室中HUVEC的生长情况。结果在脐带长度一定的情况下,HUVEC分离所得到细胞的多少以及细胞的状态与胰酶的用量、时间、温度及是否含EDTA关系密切。本研究胰酶消化时间在室温(25℃左右)情况下要消化30min,用的胰酶是含EDTA和不含EDTA的胰酶1∶1混合;长满之后传代消化的胰酶只能用不含EDTA的胰酶消化,时间以在镜下的细胞状态为准。结论在特殊材料Transwell小室中成功分离培养HUVEC,一定要在比较温和的条件下消化HUVEC,这样才可能得到活力比较好、数量比较多的细胞。

基于iTRAQ技术的猪精子释放蛋白Transwell小室分离及差异性分析

【目的】探索分离猪附睾头部精子释放蛋白的新方法,确定释放蛋白的功能特点及信号通路。【方法】利用Transwell小室独特的共培养系统,充分利用0.4μm聚碳酸酯膜分离精子释放的蛋白。使用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术分析释放的蛋白,对鉴定到的差异蛋白,使用GO数据库描述蛋白功能,运用KEGG数据库Pathway分析,确定差异蛋白最主要的生化代谢途径和信号转导途径,同时用IPR数据库对差异蛋白的结构域进行非冗余分析。【结果】Transwell小室上、下室共鉴定到542种蛋白,其中,464种蛋白表达量显著上调,78种蛋白表达量显著下调。差异蛋白主要参与跨膜转运、离子运输、ATP合成等生物过程。差异蛋白主要参与的信号通路为醛固酮调节的钠盐吸收、囊泡转运、EGFR酪氨酸激酶抑制等。硫氧还蛋白、半乳糖、糖苷水解酶等构成差异蛋白的主要结构域,为蛋白发挥作用提供结构基础。【结论】Transwell小室分离蛋白的方法切实有效,iTRAQ技术在附睾头部精子释放蛋白中成功鉴定出差异蛋白,差异性分析及功能注释为探究差异蛋白参与的生命活动及功能奠定了基础。

Transwell小室共培养条件下RPE促进Mller细胞的增殖和迁移(英文)

目的:观察在体外共培养系统中RPE对Mller细胞的影响。方法:Transwell小室共培养RPE和Mller细胞,MTT法、细胞计数法,测定Mller增殖和迁移的情况。结果:Mller细胞增殖的实验:Mller细胞的增殖,除了3h与6h,24h与48h之外,在其他各时间点之间差别有统计学意义。Mller细胞与RPE共培养组和Mller细胞单独培养组两组之间差别有统计学意义。Mller细胞迁移的实验:Mller细胞迁移,除了3h和6h之外,在其他各时间点之间差别有统计学意义。Mller细胞与RPE共培养组和Mller细胞单独培养组两组之间差别有统计学意义。在析因设计实验中,与RPE共培养、缺氧条件,这两个因素都可以分别作为独立的因素促进Mller细胞的增殖和迁移,而两者不存在协同作用。结论:正常和缺氧条件下RPE促进Mller的增殖、迁移,随共培养时间的延长RPE促进Mller增殖、迁移的作用加强。缺氧条件下RPE与Mller细胞间的相互作用在视网膜增殖性疾病中起到了重要的作用。

Transwell小室环境下人脂肪干细胞对不同年龄成纤维细胞功能的影响

目的:研究在Transwell小室环境条件下,脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)分别对青年人来源和老年人来源成纤维细胞功能的影响及其差异。方法:从人脂肪组织中分离、培养ADSCs,从青年人和老年人皮肤组织中分离、培养青年人来源成纤维细胞和老年人来源成纤维细胞,用Transwell小室建立共培养模型,细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测共培养后成纤维细胞增殖情况,RT-PCR检测共培养后成纤维细胞Ⅰ型胶原、基质金属激酶-1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)、β-半乳糖苷酶m RNA表达。结果:(1)共培养后老年人和青年人实验组成纤维细胞增殖分别高于老年人和青年人对照组成纤维细胞(P=0.000),且青年人实验组增殖高于老年人实验组(P=0.000)。(2)共培养后老年人和青年人实验组成纤维细胞的Ⅰ型胶原和β-半乳糖苷酶m RNA表达分别高于老年人和青年人对照组成纤维细胞(P=0.000),且青年人实验组的Ⅰ型胶原和β-半乳糖苷酶m RNA表达均高于老年人实验组(P=0.002、P=0.000)。(3)共培养后老年人和青年人实验组成纤维细胞的MMP-1 m RNA表达分别低于老年人和青年人对照组成纤维细胞(P=0.000),青年人实验组的MMP-1 m RNA表达低于青年人实验组(P=0.055),差异无统计学意义,此结果的产生可能与共培养后青年人成纤维细胞和老年人成纤维细胞增殖均较活跃,产生的MMP-1均较少有关。结论:ADSCs与成纤维细胞共培养,能促进不同年龄成纤维细胞的增殖能力和胶原蛋白的分泌能力。

前列腺癌细胞Transwell小室体外侵袭模型的建立及应用价值研究

目的:建立前列腺癌细胞transwell小室体外侵袭模型,并探讨该侵袭模型在前列腺癌转移研究方面的意义。方法:将200μl2组前列腺癌细胞加入Transwell小室侵袭模型上室分别培养12、24、36、48h,加入侵袭模型上室的细胞取不同浓度(1.0×105、2.0×105、3.0×105、4.0×105/m1)温箱中培养,在不同时间点观察不同浓度的前列腺癌细胞穿过基质膜的细胞数,测定2组前列腺癌细胞系的侵袭能力。结果:穿过ECM胶聚碳酸酯膜的细胞在第12h较少,而随着时间的延长逐渐增多。细胞穿膜在24小时前后最显著;同时,穿过人工基底膜的细胞数随着细胞浓度增高而增多,但细胞浓度大于3.0×105/ml时,穿过人工基底膜的细胞数无明显变化。结论:本实验成功建立了前列腺癌细胞Transwell小室体外侵袭模型,其在前列腺癌研究方面具有较高的应用价值。该侵袭模型的建立可间接判断肿瘤的侵袭力并且对探明前列腺癌的转移机制及影响因素具有重要意义。

外周血单个核细胞介导乙型肝炎病毒感染的transwell小室体外模型研究

目的观察感染HBV的PBMC经人绒毛膜癌滋养层细胞（Bewo细胞）构建的胎盘屏障迁移情况，探讨PBMC作为载体转运HBV的生物学作用。方法培养并用细胞计数试剂盒-8检测培养Bewo细胞和PBMC的增殖和活性。用HBVDNA含量为5×10^6拷贝／mL的乙型肝炎患者血清100μL感染PBMC后，用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）荧光染料标记感染的细胞，transwell小室建立Bewo细胞和感染HBV的PBMC共培养模型。用流式细胞仪检测感染HBV的PBMC迁移情况，荧光定量PCR法检测transwell下室中PBMCHBVDNA含量。结果PBMC、Bewo细胞均在接种24h左右开始增殖，120h左右开始进入生长停滞期。transwelt小室共培养0、12、24和48h，下室中绿色荧光标记的PBMC量分别为（0．445±0．021）％、（21．180±4．653）％、（34．830±7．156）％和（64．185±3．161）％，随着培养时间的延长，下室中检测到的标有绿色荧光的PBMC量越多（F=68．983，P=0．001）。共培养24、48h时，下室PBMCHBVDNA分别为（1．925±0．431）×10^3、（2．565±0．361）×10^3拷贝／mL，即下室中的PBMc发生感染。结论PBMC可以作为HBV肝外感染的靶细胞，利用transwell小室构建胎盘滋养层屏障可以为体外研究HBV跨胎盘传播提供新思路。

Transwell小室环境下小鼠不同器官微环境对人舌癌细胞生长的影响

目的:探讨骨髓和淋巴结微环境对人舌癌细胞SCC-9生长的影响。方法:利用Transwell小室建立微环境与SCC-9共培养体外模型,分为5组:SCC-9单独培养组(对照组),SCC-9+Balb/c小鼠骨髓共培养组,SCC-9+Balb/c小鼠淋巴结共培养组,SCC-9+Balb/c裸鼠骨髓共培养组,SCC-9+Balb/c裸鼠淋巴结共培养组。采用直接计数法分别于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h检测SCC-9的数量。结果:利用Transwell小室成功构建骨髓、淋巴结微环境与SCC-9共培养体外模型。计数结果显示,SCC-9在Balb/c裸鼠淋巴结共培养组中的增殖程度高于其他4组(P<0.05);在Balb/c裸鼠骨髓,Balb/c小鼠骨髓和淋巴结共培养组中均低于对照组(P<0.05),且抑制程度无明显差异(P>0.05)。结论:不同微环境可能通过不同的肿瘤休眠机制,控制肿瘤细胞的增殖与休眠,最终被动形成淋巴转移的靶向性。

Transwell侵袭小室技术的改良及其在人骨髓间充质干细胞诱导分化中的应用

目的:分离、培养和鉴定人骨髓间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs),应用改良的Transwell侵袭小室技术,探讨血管内皮生长因子(VEGF)及内皮细胞条件诱导液对其体外诱导分化中的作用。方法:采用Percoll(1·073g/ml)分离液分离骨髓单个核细胞,体外培养MSCs,流式细胞术分析鉴定MSCs的纯度,Transwell侵袭小室技术结合LSCM,实时监测MSCs在Matrigel与VEGF/内皮细胞条件诱导液构成的内皮细胞生长微环境中的运动迁移情况。结果:经Percoll分离、体外培养扩增的MSCs,细胞纯度可达95%左右;VEGF组迁移的深度虽高于对照组(P<0·05),但迁移至聚碳酸脂膜下的细胞与对照组相比,并无统计学意义(P>0·05)。内皮细胞条件诱导液促进MSCs的迁移,在Matrigel内迁移的深度及迁移至聚碳酸脂膜下的细胞均明显多于对照组(P<0·05)。结论:共聚焦激光扫描显微术与Transwell侵袭小室技术的结合,能够从时间和空间上对后者进行观察,使该实验得到改良;利用内皮细胞条件诱导液与Matrigel模拟体外内皮细胞生长的微环境,并从空间上观测了MSCs穿越人工基底膜的情况,为MSCs向内皮细胞体外诱导开辟了新的思路。

Transwell和Wound healing在细胞迁移中的应用比较

目的:比较分析transwell和划痕法(Wound healing)检测细胞迁移能力的差异,探讨两种方法在血清饥饿调节的血管平滑肌细胞迁移中的应用。方法:用DMEM和含10%小牛血清的DMEM分别作用于体外培养的大鼠血管平滑肌细胞24h,采用transwell迁移小室和划痕方法检测血清饥饿(serum starvation)和有血清条件下平滑肌细胞的迁移能力。结果:transwell法和划痕法分别显示了VSMC在血清饥饿组的迁移数目和距离明显比10%血清刺激组少和短。结论:两种方法都能较好地反映细胞的迁移能力,即血清饥饿组明显低于10%血清刺激组。但划痕法更适用于本实验。

Transwell模拟生物屏障

Transwell,即穿透小室,既是一种试验装置,也是一种试验技术。Transwell可用于生物屏障的建立、细胞共培养、细胞趋化、细胞迁移和细胞侵袭等多方面的研究。在模拟生物屏障方面,研究较多较成熟的有血脑屏障、肠黏膜屏障、血视网膜屏障、胎盘屏障和腹透屏障。本文将分别对上述五种屏障的建立进行阐述。

Transwell 接触共培养促进单散iPSCs 生长及分化

目的：观察Transwell接触共培养促进单散人诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells， iPSCs）生长及分化的作用。方法：将1～2代牛角膜内皮细胞（corneal endothelial cells， CECs）接种在Transwell 小室底面培养8 h后，应用Accutase消化及40μm过滤处理获得单散iPSCs，将其接种到已有CECs的Transwell小室内共培养14 d，前3 d使用mTeSR1培养基，第4天开始用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基。分别进行实时荧光定量聚合酶链式反应（ real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ， qPCR ）、免疫荧光、死活细胞染色及碱性磷酸酶（ alkaline phosphatase ， ALP）染色，对iPSCs多能特性表达及分化进行鉴定。设定单散iPSCs共培养组为实验组，常规培养iPSCs组为对照组（一），非共培养单散iPSCs组为对照组（二）。结果：培养牛CECs形态呈典型的六边形铺路石样外观。人iPSCs呈克隆样生长，共培养3 d后iPSCs贴壁呈单散细胞生长，免疫荧光检测未分化标志Nanog和Oct4呈阳性。 qPCR检测Nanog、Oct4和Sox2 mRNA表达，实验组与对照组（一）比较差异无统计学意义（P＞0.05）。死活细胞染色显示，实验组死细胞明显减少，与对照组（二）比较差异有统计学意义（P＜0.01）。共培养14 d后，人iPSCs形态比较均一，呈多边形，体积增大，无明显克隆团块；ALP染色阴性；免疫荧光染色ZO-1、AQP1和CD31表达阳性，CD34和CD133表达阴性。 qPCR检测Oct4、Nanog和Sox2 mRNA表达明显下调，与对照组（一）比较差异有统计学意义（P＜0．01）。结论：与牛CECs共培养可增强人单散iPSCs活性，使iPSCs形态上向内皮样细胞转化，表达部分CECs的标志。 Transwell接触共培养模型可以促进单散iPSCs生长及分化。

细胞体外侵袭实验中Transwell plate染色技术改良

细胞体外侵袭实验主要应用于肿瘤细胞侵袭和转移能力研究。该实验经常使用Transwell plate通过matrigel穿膜侵袭实验来检测肿瘤细胞的侵袭潜能。但在具体实验中获得真实、最佳实验结果图象并借以说明问题并非简单。

骨髓间充质干细胞与关节软骨细胞Transwell共培养诱导形成软骨

背景:研究证实,关节软骨细胞具有分泌诱导因子促进骨髓间充质干细胞向关节软骨细胞分化的能力,但至今未见两种细胞运用Transwell共培养诱导骨髓间充质干细胞形成软骨的报道。目的:观察在Transwell共培养系统中共培养后,关节软骨细胞诱导骨髓间充质干细胞向关节软骨样细胞转化的能力。方法:骨髓间充质干细胞来源于4周龄SD大鼠的股骨及胫骨干骨髓,关节软骨细胞来源于4周龄SD大鼠的正常股骨头表面的关节软骨。分别吸取第3代骨髓间充质干细胞和关节软骨细胞,按1:1的细胞比例分别植于Transwell共培养系统中,下室植入骨髓间充质干细胞,上室植入关节软骨细胞。同时设置相同浓度单纯骨髓间充质干细胞对照组,分别在含胎牛血清的DMEM培养基中培养,相差显微镜下观察细胞的增殖和基质合成情况,并对各组细胞爬片进行Ⅱ型胶原免疫组化染色及氨基聚糖含量检测。结果与结论:共培养组骨髓间充质干细胞数量增多,细胞外基质合成丰富,其基质能被Ⅱ型胶原免疫组化染色,细胞染色呈现黄色。氨基聚糖含量随着诱导时间增加而增多。提示关节软骨细胞分泌物具有促进骨髓间充质干细胞向关节软骨样细胞转化的能力,与此同时,骨髓间充质干细胞还能分泌促进组织细胞修复的细胞因子,使共培养中的软骨细胞功能得以加强。由此可见,软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养诱导具有独特的优势。

Transwell培养体系中人AGM区基质细胞支持脐血CD34^+细胞造血

【目的】探讨Transwell系统中人胚主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐带血造血干/祖细胞的造血能力长期维持及扩增的作用。【方法】采用免疫磁珠方法分离人脐带血CD34+细胞,接种于底层铺有人AGM区基质细胞的Transwell培养板的Inserts中,非接触共培养7-35 d,每星期取样检测细胞总数,用半同体培养基分析CFU-C及HPP-CFU集落形成数,流式细胞术检测CD34+、CD34+CD38-细胞百分率。【结果】在Transwell中非接触共培养条件下,人AGM区基质细胞培养体系较胚胎躯干基质细胞和无饲养层培养体系对有核细胞总数、CFC和CD34+细胞均具有明显的扩增作用,共培养14 d的CD34+、CD34+CD38-造血干/祖细胞均获得峰值扩增(2.62±0.8和2.15±1.04,P<0.05),而MNC总数和CFC均在21 d获得最大扩增(32.5±4.3和4.2±0.6倍,P<0.05).克隆分析发现CFU-Mix、CFU-GM、BFU-E在共培养4-5星期后均仍然可见。原始祖细胞HPP-CFC在3星期也得到2.23倍的扩增,较空白及hFT对照组均有显著性差异(P<0.05),并在共培养35 d 后仍可见HPP-CFU集落形成。【结论】人AGM区基质细胞hAGM-S3/hAGM-S4均具有造血支持作用,在非接触共培养条件下中可长期维持脐血中造血干/祖细胞的多系造血能力和高增殖潜能达21～35 d,对脐血CD34+/

Transwell技术模拟人类免疫缺陷病毒感染黏膜及其他屏障系统的应用

近年来,由于Transwell小室能在体外模拟机体许多黏膜及生物屏障系统,如人生殖道黏膜、直肠组织黏膜以及血-脑屏障、血-视网膜屏障等,重现人类免疫缺陷病毒(HIV)感染机体的过程,对HIV感染机体的机制研究极为重要,因而被广泛应用。目前,尚无有效抗HIV疫苗问世,因此开发能阻断HIV性传播的药物是有效途径之一。应用Transwell技术深入研究HIV穿透黏膜及屏障系统感染机体的机制,也能为HIV防治药物的研发寻找新的作用靶点。本文就近年来Transwell技术在HIV感染黏膜及其他屏障系统中的应用作一综述。

Transwell模拟腹膜透析屏障及相关研究进展

Transwell既是一种试验装置,也是一种试验技术。在模拟生物屏障方面,研究较多较成熟的有血脑屏障、肠粘膜屏障、血视网膜屏障、胎盘屏障和腹膜透析屏障。本文将针对腹膜透析屏障的建立、验证及应用该屏障的相关研究做一全面的阐述。

Transwell共培养条件下诱导脂肪干细胞成骨能力的改变

背景:在共培养条件下,间充质干细胞可调节成骨细胞的分化和成骨能力。目的:研究成骨细胞前体与未分化的骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞和胎盘间充质干细胞在矿化培养液中共培养对其成骨效能的影响。方法:脂肪干细胞成骨诱导7 d后获得诱导后的脂肪干细胞,将其分别与上述骨髓、其脐带和胎盘来源的间充质干细胞在Transwell小室中进行间接共培养。实验组根据间充质干细胞种类不同将其分为骨髓来源组、脐带来源组和胎盘来源组,对照组为诱导后的脂肪干细胞单独培养。在不同实验间期通过检测碱性磷酸酶活性以及定量分析钙基质沉积情况,观察不同组织来源的间充质干细胞对诱导后脂肪干细胞成骨效能的影响。结果与结论:(1)碱性磷酸酶表达活性:间接共培养条件下实验组各组碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P<0.05),实验组中骨髓来源组碱性磷酸酶活性高于脐带来源组和胎盘来源组(P<0.05);(2)钙化基质定量分析:实验组各组均显著高于对照组(P<0.05),实验组中脐带来源组高于骨髓来源组和胎盘来源组(P<0.05);(3)结果表明:诱导后的脂肪干细胞在间接共培养条件下受间充质干细胞的调节成骨能力明显提高。