EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

目的建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞,用EV71感染树鼩肾细胞,测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度,分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达,以确定EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性。结果对分离得到的树鼩原代肾细胞进行传代纯化和形态鉴别,建立以树鼩原代肾细胞为主的细胞培养。用EV71病毒感染树鼩原代肾细胞,感染后48~96 h病毒滴度可达到1.3×10~6TCID_(50)/m L,说明EV71病毒可有效感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。Western blot检测发现,EV71病毒VP1蛋白可在感染后2~8 d的树鼩原代肾细胞中有效检出,间接免疫荧光法则在感染后2~6 d细胞的细胞质中检测到病毒VP1蛋白的分布。结论在成功建立树鼩原代肾细胞培养的基础上,确定了EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性和病毒增殖特性,初步建立了EV71树鼩原代肾细胞感染模型。

树鼩肝枯否细胞的分离及鉴定

目的建立对树鼩枯否细胞(Kuffer cells,KCs)进行分离、原代培养和鉴定的方法。方法经肝活检手术分别获取6只树鼩的肝组织,后采用胶原酶体外灌注结合机械法分离肝脏细胞,经差速离心法、Percoll梯度密度离心法及贴壁法分离、纯化KCs后进行原代培养,最后通过细胞免疫组化、墨汁吞噬实验及透射电镜对KCs进行鉴定。结果树鼩肝组织分离获得的KCs数量为(1.2±0.2)×106个/g肝组织,细胞活力为90%,细胞纯度达85%以上。结论本组建立的胶原酶体外灌注结合机械分离树鼩KCs的方法稳定实用,为同一研究个体的KCs进行多次分离培养和动态观察奠定基础。

树鼩角膜原代上皮细胞的分离培养、纯化与鉴定

目的建立树嗣角膜上皮细胞(CECs)稳定的体外培养技术,为人类角膜疾病研究提供新的实验材料。方法使用改进的双酶消化法取得树嗣CECs,周转化生长因子-β(TGF-β)抑制剂配合梯度消化对树鼩CECs进行纯化,角蛋白3/12抗体对CECs进行免疫荧光检测及鉴定。结果优化的酶消化法可以快速、有效得到高纯度的树鼩CECs。TGF-β抑制剂及梯度消化法可以达到良好的纯化目的,纯化的CECs在传代过程中仍保持良好形态。树鼩CECs免疫荧光染色显示角蛋白3/12单克隆抗体阳性。结论成功建立了一种有效、简单、经济适用的树鼩角膜上皮原代细胞的体外培养技术,所获得的原代细胞具有较好的上皮细胞形态特征并可以连续传代,为眼科疾病的研究提供一种新材料。

人轮状病毒G1P[8]型感染树鼩原代小肠上皮细胞模型的建立

目的探究树鼩原代小肠上皮细胞的增殖特性,建立人轮状G1P[8]型病毒体外感染树鼩原代小肠上皮的细胞模型。方法采用胶原酶XI和中性蛋白酶I联合消化法获取树鼩原代小肠上皮细胞,经纯化和鉴定,用人轮状G1P[8]型病毒感染细胞,测定培养上清的病毒滴度和载量,并用Western blot和间接免疫荧光检测法检测人轮状病毒G1P[8]型VP6蛋白的表达情况,评价人轮状G1P[8]型病毒体外对树鼩原代小肠上皮细胞的感染性。结果分离的树鼩原代小肠上皮细胞经传代培养纯化,获得纯度达90%树鼩原代小肠上皮细胞。对树鼩原代小肠上皮细胞、原代肾细胞、HCT116细胞和MA104细胞进行轮状病毒易感性比较,确定树鼩原代小肠上皮细胞可以被人轮状病毒G1P[8]感染,培养72 h时病毒滴度可达到2.0×105TCID_(50)/m L。经Western blot和间接免疫荧光发现在人轮状G1P[8]型病毒感染树鼩原代小肠上皮细胞1~5 d均能检测到人轮状病毒VP6蛋白的表达和分布。结论确立了树鼩原代小肠上皮细胞的分离、纯化与培养方法,并建立了人轮状G1P[8]型病毒感染树鼩原代小肠上皮细胞的体外模型。

树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞的分离鉴定

目的建立树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞(OPCs)的体外分离、原代培养方法,以及鉴定技术。方法新生48 h内给树鼩施行安死术后采集大脑,去除脑膜和脑干,留下大脑皮层,然后使用胰酶和DNase I联合消化大脑皮层,分离细胞原代培养。通过采用化学分离法和差速贴壁法从原代培养中获得较为纯化的OPCs。对纯化和定向分化的细胞分别进行硫酸软骨素蛋白多糖4(NG2)、髓鞘碱性蛋白(MBP)细胞免疫荧光染色鉴定。结果纯化后的OPCs,胞体圆形或椭圆形,折光性强,有两极或三极突起,经NG2细胞免疫荧光染色,细胞纯度达97%左右。加入分化培养液后,OPCs可分化发育成熟,经MBP细胞免疫荧光染色为阳性。结论成功建立了树鼩大脑皮层OPCs的体外分离纯化培养方法。

肝细胞异型增生的产生及其与肝细胞癌发生关系的实验研究

82只实验树(鼠句)分为4组:A组26只,HBV阳性并加喂黄曲霉毒素B_1(AFB_1);B组34只,HBV阴性并加喂AFB_1;C组13只,为HBV感染者;D组9只,为HBV阴性。实验158周。A组发生LCD16例(61.53%),其中9例(56.25%)发生肝细胞癌(HCC)。B组出现LCD 18例(52.94%),其中3例发生HCC(16.66%)。C组出现LCD 6例(46.15%);D组无LCD产生。82只树(鼠句)有40只出现LCD,其中12只(30%)发生HCC;而无LCD的42只,只有1例(2.83%)产生HCC。它们之间发生HCC的危险性相差12.6倍。血清HBV阳性的树(鼠句),其LCD发生率显著高于HBV阴性者(6/13对0/9.P<0.05);在HBV阴性的动物中,摄入AFB_1的其LCD发生率也同样比未摄入者高(18/34对0/9,P<0.05)。表明HBV和AFB_1都能诱发LCD;LCD可能是HCC的癌前病变。