梅毒螺旋体TpN15-47融合基因原核表达系统的构建

目的构建梅毒螺旋体TpN15-47融合基因及其原核表达系统。方法分别克隆TpN15和TpN47基因,利用T4连接酶构建TpN15-47融合基因,常规方法构建其原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白TpN15-47表达情况。结果连接的TpN15-47基因测序分析表明,插入的基因片段为TpN15-47融合基因,与GenBank报道相同。目的重组蛋白TpN15-47表达产量约为细菌总蛋白85.79%,主要以包涵体形式存在。结论所构建的原核表达系统能高效地表达TpN15-47融合蛋白,为后期梅毒螺旋体基因疫苗和临床检测试剂盒的研制奠定了基础。

ltB-TpN47融合基因原核表达系统的构建

目的分别从梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)临床菌株和大肠杆菌DNA中扩增ltB和TpN47基因,构建ltB-TpN47融合基因及其原核表达系统。方法采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增TpN47基因和ltB基因片段、构建ltB-TpN47融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列。采用质粒pET32和宿主菌E.coliBL21DE3构建ltB-TpN47融合基因原核表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达。结果所构建的ltB-TpN47融合基因核苷酸序列与从GeneBank中查询并处理得出的数据基本一致。所构建的表达系统pET32-ltB-TpN47的目的重组蛋白(rltB-TpN47)表达量高达细菌总蛋白的1/3左右。结论本文成功地构建了ltB-TpN47融合基因高效原核表达系统。

梅毒螺旋体TpN47基因分析及实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的确定不同梅毒螺旋体TpN47基因序列的差异性及其跨膜结构,建立基于TpN47基因检测梅毒螺旋体的荧光定量PCR方法。方法通过使用NCBI/Blast,Pfam,TMHMM Server v.2.0等网络资源分析梅毒螺旋体TpN47基因编码蛋白的保守功能结构域和跨膜区域。根据参考序列设计引物,采用PCR技术从梅毒螺旋体基因组DNA中扩增TpN47基因,将其连接入克隆载体pMD18-T进行测序,并用DNASTAR软件比较不同梅毒螺旋体菌株TpN47基因的核苷酸序列。根据梅毒螺旋体TpN47基因保守区域设计引物,建立基于该目的基因的荧光定量分析PCR检测方法并分析其灵敏度、特异性和稳定性。同时,采用基于TpN47基因的荧光定量PCR对梅毒螺旋体感染患者血液样本进行检测。结果研究表明,梅毒螺旋体TpN47基因为梅毒螺旋体外膜蛋白编码基因,其产物定位于外膜表面。不同梅毒螺旋体菌株中TpN47基因的核苷酸序列保守,相似度达99%以上。基于TpN47基因的荧光定量PCR方法可有效地检测梅毒螺旋体感染患者血清及泌尿道分泌物样本中的梅毒螺旋体。结论 TpN47基因为梅毒螺旋体外膜蛋白编码基因,建立的基于TpN47基因的荧光定量PCR方法具有快速、敏感、稳定等优点,适用于梅毒螺旋体临床实验室诊断。

梅毒螺旋体荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立基于TPN47基因检测血液中梅毒螺旋体的荧光定量PCR检测方法。方法根据梅毒螺旋体TPN47基因的参考序列设计引物和探针,对收集到的200份血液样本进行荧光定量PCR检测,并分析其灵敏性和特异性,同时,对扩增片段进行测序确认。结果荧光定量PCR方法可以扩增到梅毒螺旋体TPN47基因区164 bp长DNA片段,此方法特异性和敏感性都很高;基于TPN47基因的荧光定量PCR方法测定,TPPA阳性血清和TPPA阴性血清的符合率分别为99%(198/200)和98%(196/200)。结论以TPN47基因为扩增的荧光定量PCR方法具有灵敏、快速、便宜等优点,适用于梅毒螺旋体临床实验室诊断。