降解赤霉病菌毒素的Tri101基因研究进展

概述了降解赤霉病菌毒素的Tri101基因的结构和功能,并对其近几年在转基因方面的研究进展做一综述,探讨食物和饲料中真菌毒素经济、高效和安全的净化方法,进而提高作物产量和食品安全性,避免真菌毒素在健康方面给人类造成的不良影响。

哈茨木霉菌Tri101基因的克隆与序列分析

根据拟枝孢镰刀菌等真菌中Tri101的保守序列设计简并引物,利用简并PCR和基因组步行法克隆了哈茨木霉菌Tri101基因.结果表明:Tri101基因的开放阅读框为1 314 bp,无内含子存在,与预计的Tri101序列特征一致.该基因编码蛋白质由437个氨基酸组成,预测相对分子质量约为4.75 kD,系统进化树显示其与棒曲霉(Aspergillus clavatus)NRRL 1亲缘关系最近,与NRRL 1中3-O-乙酰转移酶的的蛋白质同源性达到55%.Blast数据库分析表明其属于转移酶总科,单端孢酶烯乙酰转移化酶.以禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)TRI101蛋白(Parent PDB:3b2s Chain:A)的晶体为模板进行了同源建模,为进一步研究该基因的功能奠定基础.

降解赤霉病菌毒素Tri101基因的原核表达及抗体制备

采用RT-PCR方法克隆了编码禾谷镰刀菌单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶Tri101基因的cDNA序列,并连接到原核表达载体pGEX-4T2上,将获得的重组载体pGEX-4T2/Tri101转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,经IPTG诱导后,Tri101基因在大肠杆菌BL21中获得了高效表达,融合蛋白GST-Tri101分子量为75.45 kDa。将该融合蛋白切胶纯化后免疫家兔,制备兔抗GST-Tri101多克隆抗体。经ELISA法测定抗体效价大于1∶256 000。Western blot分析表明制备的抗体与原核细胞体外表达的Tri101蛋白可以特异性结合,表明该抗体的特异性良好。应用该抗体验证了感赤霉病小麦中Tri101基因的表达。兔抗GST-Tri101抗体的成功制备,为进一步研究Tri101的生物学功能、细胞定位以及在其它植物中的表达等奠定了基础。

禾谷镰刀菌降解毒素基因Tri101的克隆和序列分析

禾谷镰刀菌Tri101基因编码的单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶可通过加乙酰基的形式使禾谷镰刀菌产生的单族毒素(如DON)转变为较低的毒性。本研究利用RT-PCR技术从禾谷镰刀菌0623中扩增并克隆了Tri101基因的cDNA片段,测序结果表明,Tri101基因核苷酸序列阅读框架全长1356bp(GenBank序列号:GQ907236),编码451个氨基酸的多肽,推测分子量为49.45kD,等电点为5.14。氨基酸序列同源性比对结果表明,它与Kimura报道的禾谷镰刀菌Tri101氨基酸序列同源性最高,为99.56%,与其它13种镰刀菌的Tri101氨基酸序列的同源性分别为97.91%-75.68%。系统进化树分析结果表明,Fusarium graminearium0623与Fusarium sporotrichioides属于同一进化枝且与Fusarium asiaticum有较近的亲缘关系,而与F.oxysporum、F.moniliforme、F.nygamai、F.nisikadoi和F.decemcellulare的亲缘关系较远。