通过灭活原生质体融合选育啤酒酵母新菌株

将生产用啤酒酵母（ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＬＱ１６ 和ＱＳＢ７ 分别进行单倍体化，并筛选ＬＱ１６（Ｉｌｅ － ，Ｄａｔｒ） 和ＱＳＢ７（Ａｌａ－ ，Ｈ２Ｓ－ ） 的遗传标记。经摇振培养后，酶解制备原生质体，对前者进行紫外灭活，而后者进行热灭活，再利用ＰＥＧ 进行融合，在ＭＭＲ 和ＳＭＭＲ 培养基上再生，挑选融合子。连续传代稳定后鉴定融合子ＱＳＢＸＩ６ 。通过细胞体积和生物量的测定，以及遗传型的分析和细胞ＤＮＡ 含量测定等均证实了获得的是融合子。经对啤酒感观评价，双乙酰含量测定与多种成分的气相色谱分析以及啤酒的发酵度，絮凝性、稳定性测定，并经连续多次生产试验证实ＱＳＢＸＩ６ 是一株口味独特、发酵度高、絮凝性强、遗传性能稳定兼具有多种优良性状的啤酒酵母生产新菌株。

灭活原生质体融合技术选育苏云金杆菌新菌种——原生质体融合条件的研究

利用双灭活原生质体融合技术获得了苏云金杆菌新菌株。着重对原生质体制备、再生、灭活及融合的实验条件进行了报道。

树状多节孢的双亲灭活原生质体融合

以紫杉醇产生菌树状多节孢HQD33的诱发突变株UL50-6为出发菌株，将收集到的出发菌株UL50-6和UL40-19的菌丝体分别用pH5.5-6.0的0.7mol/L NaCl配制的3%溶壁酶、2%蜗牛酶、1%溶菌酶组成的复合酶系，30℃恒温酶解3-5h，制备原生质体。两菌株的原生质体经纯化后分别用热和紫外线灭活，其中UL50-6的原生质体在54℃热灭活5分钟，UL40-19的原生质体在30W紫外灯下，30cm，照射85秒进行紫外灭活，双亲株的原生质体存活再生率为零。同时对融合条件进行了初步探索，以含有Ca^2+和Gly的35%-40%的PEG作为融合剂，融合时间为20分钟时，融合率可以达到4.44×10^-2-6.92×10^-2。对融合株TPF-1与双亲株的形态学、可溶性蛋白、过氧化物同工酶进行分析，确证其为双亲株的融合子。

食用菌灭活原生质体电融合及属间融合产物的鉴定分析

食用菌因其显著的营养、保健、药用及综合利用价值受到世人青睐。原生质体融合技术则为食用菌的育种和遗传学研究提供了一条很好的途径。食用菌的种内、种间乃至属间、目间的原生质体融合均已有过报道,但这些工作大多利用营养缺陷型标记的亲株,采用化学融合法完成。这种融合的效率较低,对亲株的标记繁琐费时,甚至会对菌株性状产生不良影响。最近,一种具有较高融合效率的物理融合法——电融合法以及非遗传性标记法分别被一些研究者所采用。本研究将原生质体电融合法与灭活标记法相结合来获得食用菌的属间融合产物,并采用包括同工酶分析和RAPD(或AP-PCR)方法在内的分子生物学方法,对食用菌属间杂交后代的遗传学特性进行初步探讨。 1

灭活原生质体融合技术提高豆鼓纤溶酶菌产酶量

以豆豉纤溶酶产生菌株蜡状芽孢杆菌UV-101和MW-101作为亲本菌株,首先对亲本原生质体进行紫外灭活,然后用PEG(6000)作为融合剂对灭活双亲进行原生质体融合。通过对再生平板上长出的融合子进行平板初筛和摇瓶复筛,最终获得一株高产菌株PF-101,其酶活比亲本菌株分别提高了74·47%和86·36%,并且该菌株具有良好的遗传稳定性。

猕猴桃酒优质酵母的筛选及原生质体电融合条件初探

通过对发酵力、耗糖速率的测定,结合发酵过程中酸度的变化,从16株酵母菌中筛选出2株作为原生质体电融合的亲本菌株,对其原生质体制备及再生条件进行了研究。确定了两亲本的灭活条件和原生质体电融合的2项基本参数。结果表明,两亲本的最佳酶解去壁条件为酶量16mg/mL,酶解时间60min,亲本WF58最佳热灭活时间为15min,亲本WF65最佳紫外灭活时间为40min;采用BTX830型细胞融合仪,最佳的脉冲场强为2000V/cm,最佳的脉冲时间是30μs。

全基因组重排育种技术提高豆豉纤溶酶菌产酶量

枯草芽孢杆菌DC-12是从豆豉里面筛选出来的,具有纤溶酶活性的菌株。采用了全基因组重排技术提高DC-12的产酶量,首先通过对DC-12进行紫外诱变和亚硝酸诱变构建重组突变库,在研究其原生质体制备和再生的基础上,以其中4株诱变菌株作为直接亲本,采用电融合的方法进行两次多亲本的全基因组重排,结合双灭活的筛选方法,共筛选出2株酶活大大提高并能稳定遗传的菌株,使亲本菌株的酶活提高了4～5倍,最高达2710IU/ml。

非对称灭活双亲原生质体融合法选育产果糖基转移酶的米曲霉新菌株的研究

本文以生产果糖基转移酶的米曲霉SBB201(Aspergillus oryzae SBB201)为出发菌株,通过紫外联合氯化锂诱变获得产酶性能与生长性能各自优良的米曲霉菌株UV-A与UV-B,采用非对称灭活法对这两株菌株的原生质体进行紫外以及热灭活双灭活,然后在PEG作为融合剂的介导下进行原生质体双亲融合,筛选出一株果糖基转移酶生产能力有较大提高的米曲霉新菌株,其酶活力达到了172.95 U/g,比出发菌株提高了64.57%。

单亲灭活德氏乳杆菌和乳酸乳球菌原生质体融合条件优化

利用单亲灭活原生质体技术对德氏乳杆菌FQ菌株和乳酸乳球菌FL菌株的原生质体进行融合,考察原生质体制备、再生和融合条件的影响因素。结果表明:制备德氏乳杆菌FQ菌株原生质体最适条件为温度37℃,在含有10μg/mL变溶菌素和1mg/mL溶菌酶溶液中超声处理90min。在此条件下,原生质体再生率可达6.36%。乳酸乳球菌FL菌株添加1mg/mL甘氨酸处理后,用10mg/mL溶菌酶37℃恒温酶解90min,原生质体形成率可达99.97%。65℃处理乳酸乳球菌FL菌株原生质体120min,原生质体灭活率可达96.89%。融合实验结果表明,在PEG6000 400g/L(含0.02mol/L MgCl2和0.01mol/L CaCl2)、融合时间5min、融合温度20℃、pH6.5的条件下促融,德氏乳杆菌FQ菌株和乳酸乳球菌FL菌株原生质体的融合率可达2.72×10-6。

蛹虫草虫草素高产原生质体融合子鉴定与筛选

以蛹虫草（Cordyceps militaris）4号和8号菌株作为亲本，采用灭活原生质体融合技术获得228个再生菌株。酯酶同工酶与ISSR—PCR方法相结合鉴定融合子，以虫草素含量和子实体性状为筛选指标，经过初步的遗传稳定性测试，得到虫草素含量显著提高的5个稳定融合子——CM59、CM61、CM69、CMl36和CMl86，其虫草素含量分别为8号菌株的1．17～1．73倍。实验证明融合子菌丝中虫草素含量普遍提高。筛选得到的5个融合子经进一步遗传稳定性验证后可用于以获得虫草素为目的的菌丝体发酵培养。

纤维素直接发酵乙醇微生物的选育──Ⅰ.里氏木霉原生质体钝化与检测

液体培养16至20h的里氏木霉（TrichodermaTeeseiQM9414）菌体，用0．9mol·L-1的氯化钾或20％的蔗糖为高渗缓冲液时，2．5g／L或5．0g／L质量浓度的纤维素酶和蜗牛酶混合液，30℃处理60～180Amin，可以获得稳定的原生质体。用50～55℃处理60min，或紫外线处理5min或0．1％碘乙酸30℃处理40min，原生质体全部失活。用0．03％～0．1％的中性红染色，钝化的原生质体全部着色，这是一种简便检测原生质体失活的新方法。

麦角菌与雀稗麦角菌种间灭活原生质体融合

探索了在麦角菌中进行省却营养缺陷型标记的种间灭活原生质体融合。亲株Ⅰ（Ｃ．ｐｕｒｐｕｒｅａ，麦角隐亭产生菌）用紫外线灭活（１５Ｗ，照射距离３０ ｃｍ ）７５ ｍ ｉｎ，存活率约６×１０－ ５；亲株Ⅱ（Ｃ．ｐａｓｐａｌｉ，麦角酰胺产生菌）用热灭活（５０～５２℃）６０ ｍ ｉｎ，存活率为零。融合后的再生菌落均为亲株Ⅰ的形态，其再生频率比灭活的亲株Ⅰ提高约２０ 倍，推测绝大多数为融合子。后者经５ 次传代，大多数的产碱能力与亲株Ⅰ相当或略有提高。

地中海拟无枝酸菌原生质体电融合及其在提高利福霉素SV发酵效价中的应用

对产利福霉素SV的地中海拟无枝酸菌 (Amycolatopsismediterranei)原生质体进行热灭活和紫外灭活标记 ,其热灭活条件为 5 2℃ ,1.5h ,紫外灭活条件为紫外线照射 ( 15W ,2 5cm ,2 70nm) 6 0min。将双灭活标记的原生质体用CRY 3型细胞融合仪进行电融合 ,得出 :成串电流频率 1.5MHz ,电压 5 8V ,成串时间 2 0s ,融合脉冲幅宽 80 μS ,融合电压 5 0 0V ,融合槽间距 0 .5mm时 ,融合率最高为 9.3× 10 -4 。对筛选的融合子产量试验表明 ,5 0 %以上的融合子产量高于出发菌株 ,有明显的正变作用 ,将融合子在利福霉素代谢类似物平板上分离纯化 ,获得了化学效价提高 30 %以上的产量稳定菌株。

水稻(Oryza sativa)原生质体经钝化后诱导融合再生可育体细胞杂种

本研究在初步实现水稻原生质体培养的程序化后,选用普通栽培稻P339和特种稻苏御糯选的原生质体为融合亲本,利用碘乙酸(IA)和罗丹明-6G(R-6G)这两个代谢互补抑制剂钝化处理亲本原生质体,确定了合适的抑制条件。P339用0.25mmol/L IA,苏御糯选用50μg/ml R-6G分别经30min钝化处理,通过PEG和高Ca^(2+)、高pH法诱导融合,异源融合体具有代谢互补效应,经培养得到愈伤组织17块,并进一步分化获得不同形态的再生植株12棵。移栽存活的再生植株成熟后可育,通过对这些植株的形态以及酯酶和过氧化物酶同工酶电泳的分析表明是融合后的体细胞杂种植株。

突脐蠕孢与弯孢原生质的双亲灭活融合

采用灭活原生质体方法,对致病力强、产孢量低的突脐蠕孢EM菌株和致病力较弱、但产孢量高的弯孢CL菌株两株稗草致病菌进行原生质体融合,通过观察形态、生物学及抑草活性等特性筛选融合子。结果表明,2%溶壁酶+2%蜗牛酶处理获得两亲株的原生质体释放数量最高,CL和EM分别达1.25×106个/ml和1.21×106个/ml;再生培养基○c处理的CL和EM原生质体再生率分别达14.7%和13.2%。EM利用热灭活55℃5min;CL利用紫外灭活30s,距离20cm,照射时间4min;聚乙二醇促融,获得3个融合子。融合子在孢子形态上与亲株存在明显差异,其菌丝生长速度、孢子产量、对稗草根生长的抑制作用等也与双亲菌株有差异。

双亲灭活原生质体融合技术在草菇耐低温菌株选育上的应用

为了选育耐低温草菇菌株,以草菇V23、V3552为亲本,采用酶解法制备原生质体,用紫外诱变、化学诱变两种方法对草菇菌株进行诱变,筛选到耐低温的突变株;然后利用紫外灭活(20 W,30 cm,110 s)和热灭活(50℃3 min)的双亲灭活标记法对突变株进行化学融合,结果表明在400 g/L的PEG6000、pH 8.0、融合时间30 min和融合温度32℃的条件下融合率最高,达到0.517%,共获得200个融合子。经过0℃低温筛选,最终获得15株草菇耐低温菌株,菌丝在0℃的耐冻能力提高了4.5倍。经出菇实验证明其子实体与出发菌株相比具有明显的耐低温性,液化现象明显推迟,说明该方法筛选出的菌株具有进一步应用开发的价值。

原生质体电融合选育米曲霉新菌株的研究

本实验对米曲霉AS3．951和CICC2339的原生质体进行紫外灭活,然后对灭活双亲用CRY-3型细胞电融合仪进行原生质体电融合。通过筛选得到EF113和EF222两株融合株,其酶活力分别达到了7680U/g和7200U/g,远高于酶活低的亲本菌株AS3．951。

不同灭活方法在原生质体融合选育米曲霉菌株中应用的研究

实验选取生长速度快的米曲霉菌株AS3.951和产酶活力高的米曲霉菌株CICC2339为对象菌,通过探讨紫外、微波、超声波-热三种不同的物理灭活方法进行米曲霉的原生质体融合,并比较不同方法灭活后进行原生质体融合所得米曲霉融合菌株的性状。结果表明,AS3.951采用紫外灭活、CICC2339采用超声波-热灭活时其融合率最高为6.69%,以此方式筛选得到的融合菌株AC126、AC171产酶能力均高于产酶活力高的亲本菌株CICC2339,且遗传稳定。

双亲灭活原生质体融合选育高性能酒精酵母菌的研究

为了选育高性能的酒精酵母菌,利用双亲灭活和PEG诱导,对酿酒酵母GGFS16和GJ2008单倍体细胞进行了原生质体融合。从42株融合子中筛选得到了2株融合菌株RH3和RH5,分别适合于木薯粉和甘蔗汁酒精发酵,且较好的保持了亲本的特性。其中RH3在耐酸能力上,RH5在酒精耐受能力上要优于亲本,RH3的遗传稳定性要优于RH5。

降解多菌灵木霉Tr1原生质体制备及再生条件研究

研究可降解多菌灵的木霉菌株Tr1的原生质体制备及再生的适宜条件,发现该菌原生质体制备的最佳条件为菌龄20 h,裂解酶液为5 mg/m L的溶菌酶和蜗牛酶的混合酶液,二者使用前按照体积比2∶1混合,酶解温度30℃,50 r/min缓慢振荡酶解2.5 h,渗透压稳定剂为0.7 mol/L KCl,原生质体产量达6.44×106个/m L。原生质体再生的优化条件为:PDA为培养基,添加0.3 mol/L KCl和0.3 mol/L环己六醇作为渗透压稳定剂,采用双层固体培养方式,有助于原生质体的再生。