我国旋毛虫Ts254 DNA探针制备及序列测定

我国云南猪体旋毛虫分离株（ＢＳ）经随意扩增的多态ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）方法产生的２５４ｂｐ条带，以地高辛（ｄｉｇｏｘ－ｉｎｉｎ）标记制成探针（Ｔｓ２５４），将此探针与７株旋毛虫总ＤＮＡ进行斑点杂交，出现明显的杂交斑点，检出的ＤＮＡ量为１ｎｇ。但与其它相关寄生虫、质粒ｐＢＲ３２２、昆明株小鼠肌肉ＤＮＡ均未出现杂交反应，表明Ｔｓ２５４探针具有一定的特异性和较高的敏感性。将此Ｔｓ２５４ＤＮＡ片段克隆进Ｍ１３ｍｐ１８／１９噬菌体，扩增后，筛选阳性重组子，抽提单链后测序。经Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ序列数据库检索，Ｔｓ２５４序列与真核ＤＮＡ及结构ＲＮＡ序列无有意义的同源性，此旋毛虫ＤＮＡ序列为我国首次报道。

应用PCR检测旋毛虫DNA的研究

根据旋毛虫幼虫１．６ｋｂ基因序列而设计合成引物，并进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）以检测含鼠肌肉旋毛虫幼虫及纯幼虫。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，可见扩增出了特异的６７０ｂｐ与５００ｂｐ大小的ＤＮＡ条带，而正常肌肉对照未见扩增出此条带。本法可检测０．０１条幼虫产物。

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的免疫筛选

目的 获取具有抗原性的旋毛虫新生幼虫基因。 方法 以旋毛虫感染猪血清为抗体探针 ,对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选 ,将获得的阳性克隆进行测序及分析。 结果 从 4 5× 10 5旋毛虫新生幼虫cDNA文库重组子中共获得 15 8个阳性克隆。序列分析结果表明 ,其中有 3 6个新的cDNA序列 ,已报道的序列有 5个 ,有 12个序列无开放阅读框架 (ORF) ,与旋毛虫线粒体基因组DNA同源。

用SSR-PCR和RAPD技术研究中国不同地域旋毛虫株的遗传变异

目的 对中国不同地域的旋毛虫株基因组DNA进行多态性分析 ,并为其种及种下分类提供依据。方法 采用微卫星锚定PCR(SSR PCR)及随机扩增多态性DNA技术 (RAPD)对我国 6旋毛虫株基因组DNA进行PCR扩增 ,根据扩增产物电泳条带情况进行SAS分析 ,计算遗传距离并构建进化树。结果 T3、T7与国内各地域株间遗传距离均大于 0 85 ;湖北株与天津株、黑龙江株与云南株之间的遗传距离均小于 0 2。河南株与前 4株的遗传距离在SSR PCR小于 0 3,在RAPD小于0 6。结论 中国 6株旋毛虫在基因水平可分为不同层次的 3类 :a 湖北株、天津株为一类 ;b 黑龙江株、云南株为一类 ;c 不明株与河南株归为一类或者不明株归为a类中。国内 6株归属于T1。此外 ,国际标准株T3。

旋毛虫肌幼虫RNA的提取及目的基因的PCR扩增

用改进的ＡＧＰＣ法成功地提取出旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ。每０．１ｍｌ压积虫体可获得１００μｇ的ＲＮＡ，其Ａ２６０与Ａ２８０及Ａ２６０与Ａ２３０的比值均接近于２，变性琼脂糖凝胶电泳显示，旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ缺少大部分真核生物所具有的２８ＳｒＲＮＡ。通过比较研究，筛选出理想的虫体处理方法。用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）直接从总ＲＮＡ中进行目的基因的扩增，得到一分子量为０．７ｋｂ的ＤＮＡ。通过限制性内切酶对其消化鉴定，证明扩增片段中的酶切位点与已知序列中的完全一致。

旋毛虫DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的研究

目的 观察旋毛虫DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答。方法 将旋毛虫肌幼虫编码 31kDa抗原结构基因真核表达质粒pcDNA3-TspE1分别用肌肉注射和基因枪免疫BALB/c小鼠 ,免疫血清用旋毛虫肌幼虫冰冻切片及石蜡切片抗原进行IFAT检测 ,并用旋毛虫肌幼虫可溶性抗原进行Westernblot分析。结果 IFAT表明 pcDNA3-TspE1接种BALB/c小鼠后产生的免疫血清与旋毛虫肌幼虫可产生阳性反应 ,在肌幼虫冰冻及石蜡切片上均显示黄绿色荧光。Westernblot检测结果显示 ,pcDNA3-TspE1接种小鼠后产生的免疫血清只能识别旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中的 31kDa抗原组分 ,而 pcDNA3质粒接种小鼠后的血清不能与旋毛虫肌幼虫可溶性抗原发生免疫反应。结论 旋毛虫DNA疫苗 pcDNA3-TspE1能够诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。

旋毛虫DNA疫苗在中国仓鼠卵巢细胞中的表达(英文)

目的 观察编码旋毛虫相对分子质量 (Mr) 3 10 0 0抗原的DNA疫苗 (重组真核表达质粒pcDNA3 TspE1)在中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞中的体外表达 ,并分析其表达产物的抗原性。 方法 通过用阳离子脂质体Lipofectamine 2 0 0 0将重组质粒pcDNA3 TspE1转染CHO细胞 ,G418筛选阳性克隆 ,用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、间接荧光抗体试验 (I FAT)、十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)对表达产物进行鉴定。 结果 RT PCR结果显示 ,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞在 876bp处有一条带 ,而用空质粒pcDNA3转染的CHO细胞未出现条带 ,表明pcDNA3 TspE1转染细胞中有TspE1基因转录。IFAT结果显示 ,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞与重组融合蛋白免疫小鼠血清反应呈现亮绿色荧光 ,而pcDNA3转染的CHO细胞及未转染细胞呈现橘黄色。Westernblotting显示在pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞培养液中存在有一Mr约 3 10 0 0的蛋白带 ,且该条带能被重组融合蛋白免疫小鼠血清、旋毛虫肌幼虫可溶性抗原免疫兔血清、感染旋毛虫的小鼠及旋毛虫病患者血清识别。 结论 重组质粒pcDNA3 TspE1可转染CHO细胞 ,旋毛虫TspE1基因可在转染的CHO细胞中表达 ,表达蛋白能分泌到细胞培养上清中且具有旋毛虫?

PCR检测鉴别我国5个旋毛虫地域株的研究

为明确我国不同地域株旋毛虫分子分类概况，采用扩增长度片断多态性（AFLP）对来源于云南、湖北、西安、天津、黑龙江5个地区的旋毛虫株作PCR研究。使用引物为P1株旋毛虫1．6kbDNA重复序列，质粒pPRA设计的A1、B1，模板DNA酚、氯仿、异成醇抽提和粗提DNA两种，经反复多次扩增，1．5％琼脂糖凝胶电泳。5个地域株均获得稳定的500hP条带，湖北与天津株还获得非稳定的670hP条带。与国外文献报道比较，中国大陆各地域株旋毛虫与欧洲各株旋毛虫有明显差异，与香港株相近。大陆各地的地域株之间差异不明显，仅见湖北、天津株与其它3个地域株有不稳定的差异。

旋毛虫pcDNA3.1/Ts87重组质粒的构建和表达

目的 构建和表达旋毛虫重组质粒。方法 PCR法在旋毛虫抗原基因Ts87两端加上合适的酶切位点和KOZAK序列,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1/Ts87重组质粒。采用Lipofectamine介导的细胞外源DNA转染法,把重组质粒导入COS7细胞。分别用肌肉注射和基因枪免疫小鼠。结果和结论 成功构建pcD-NA3.1/Ts87重组质粒,并在COS7细胞和BALB/c小鼠体内表达。

旋毛虫43ku ES抗原基因表达水平的实时荧光定量PCR检测

根据GenBank中旋毛虫43 ku ES抗原基因(Ts43)序列设计引物和探针。以管家基因18 SrRNA为内参基因,对旋毛虫总RNA进行归一化处理,根据循环阈值(Ct值)的变化计算Ts43基因的表达量,建立检测旋毛虫Ts43表达量的实时荧光定量PCR方法,并用该方法测定旋毛虫不同寄生时期Ts43基因的表达水平。结果显示,旋毛虫Ts43基因在各寄生时期均有表达,成虫和新生幼虫Ts43基因的表达水平相对于其他寄生时期的虫体低,该基因表达量在感染后第18 d开始逐渐上升,于感染后第30 d达到高峰,而后开始逐渐下降,但感染后第58 d的虫体Ts43基因表达水平仍高于成虫和新生幼虫。结果表明,Ts43基因的表达与保姆细胞的形成有较大关系。

不同地理株旋毛虫细胞色素氧化酶Ⅰ基因多态性的PCR-单链构象多态性分析

目的:观察不同地理株旋毛虫细胞色素氧化酶Ⅰ(COXⅠ)基因片段的多态性。方法:根据旋毛虫mtD-NACOXⅠ设计引物,应用PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对我国7个猪源旋毛虫(Trichinella spiralis,T1)地理株(河南、湖北、云南、西安、天津、黑龙江同江及哈尔滨株)与1个波兰猪源旋毛虫(T1,编号ISS3)地理株进行COXⅠ基因片段多态性进行分析。结果:我国7个猪源旋毛虫地理株与波兰地理株COXⅠ基因均扩增出约400bp的片段,PCR扩增产物经SSCP检测发现有3种基因型(AA、AB和BB),波兰地理株为AA型,黑龙江同江、哈尔滨、西安、云南、湖北及河南株均为AB型,天津株为BB型,其中以AB基因型频率最高(0.75),AA与BB基因型均为0.125;A和B等位基因频率均为0.5;旋毛虫不同地理株COXⅠ基因的多态性信息含量为0.375,为中度多态性。结论:8个不同地理株猪源旋毛虫的COXⅠ基因为中度多态性。

应用特异性引物检测中国不同地区旋毛虫DNA

根据Ｊｅａｎ－Ｄｕｐｏｕｙ－Ｃａｍｅｒ所报道１．７ｋｂ基因序列而设计合成的引物，对中国九个地区的旋毛虫株的肌组织旋毛虫ＤＮＡ进行了聚合酶链反应（ＰＣＲ）。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见中国猪源旋毛虫均扩增出特异性的６０２ｂｐ和２３０ｂｐ大小的ＤＮＡ条带，而中国犬源和猫源以及正常对照肌组织ＤＮＡ均未扩增出特异性片段。本法对中国猪源旋毛虫可检测到０．０２条旋毛虫ＤＮＡ，具有高度的特异性和敏感性。

我国4个旋毛虫分离株DNA限制性酶切片断长度差异的比较研究

报告我国云南、河南、沈阳（猪）以及长春（犬）４个旋毛虫分离株，用１０种限制性内切酶分析比较其基因组ＤＮＡ酶切片断长度差异。结果表明：来自猪体与来自犬体的旋毛虫酶切图谱不同，显示宿主的不同比地理位置、气候条件差异在旋毛虫的分类上更有意义。

我国7株旋毛虫基因组DNA的研究

对我国７株旋毛虫基因组ＤＮＡ，采用５种限制性内切酶分析表明，来自猪体的旋毛虫酶谱相似，来自犬、猫体的旋毛虫酶谱相似，而猪体与犬、猫体的旋毛虫酶谱差异明显。同时采用随意扩增的多态ＤＮＡ分析，引物为：５＇ＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣ３＇，各分离株显示自己特有带型。比较不同地区猪体或犬、猫体的旋毛虫及同一地区不同宿主的旋毛虫的相似率。提示：地区差异愈大，相似率愈小；宿主亲缘愈远，其相似率愈小。似乎我国旋毛虫可分为两群：一群是猪体旋毛虫，另一群是犬、猫体旋毛虫。

我国首次发现乡土旋毛虫的研究报告

目的 :对我国两株旋毛虫进行虫种归属鉴定。方法 :通过生物学特性的比较研究。结果 :单对虫体杂交试验 ,表明河南猪株与黑龙江犬株存在生殖隔离现象 ;冷冻耐力试验 ,在 - 15℃下 ,前者 9d即死亡 ,后者可存活 1年以上 ;在 4℃ ,前者肌肉期幼虫呈圆盘状卷曲 ,后者呈螺旋状卷曲 ;生殖力指数 ( RCI)在小鼠试验分别为 195.7和 6.2 ( P<0 .0 1) ,在大鼠分别为 191.3和 14.4 ( P<0 .0 1) ;前者对家猪易感 ,后者不易感 ;随机扩增多态性 DNA指纹分析其扩增后产物的 DNA片段电泳带型 ,河南猪株旋毛虫与 T.spiralis基本相同 ,黑龙江犬株旋毛虫与 T.nativa一致。结论 :我国至少存在上述两种旋毛虫 ,即 :河南猪株旋毛虫系 T.spiralis,黑龙江犬株旋毛虫系 T.nativa。

旋毛虫排泄分泌抗原p49基因的克隆

应用ＤＮＡ重组技术将编码旋毛虫肌幼虫４９ＫＤａ抗原的基因克隆于大肠杆菌中．设计特异的ＰＣＲ引物，用ＰＴ－ＰＣＲ技术直接从旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ中反转录并扩增出约１．１Ｋｂ的靶ＤＮＡ．用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶解后将其克隆到质粒载体ｐＵＣ１９中，用Ｘ－ｇａｌ培养基筛选重组子．该重组子经相同的核酸内切酶水解获得约２．７Ｋｂ和１．１Ｋｂ两个片段，分别与ｐＵＣ１９和目的基因的大小相同，目的基因经序列分析并与文献报道的序列比较发现具有９７．８％的同源性．

旋毛虫河南株TspE1基因克隆及多态性分析

目的:构建旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码相对分子质量为31 000的蛋白抗原结构基因(TspE1)的重组质粒(pUC18－TspE1),测定TspE1基因序列,分析旋毛虫河南株的基因多态性。方法:根据TspE1基因已知序列设计合成一对引物,采用RT-PCR技术获取旋毛虫成囊前期幼虫目的基因,PCR产物经纯化后用BamHI、HindⅢ进行双酶切,定向克隆人 pUC18质粒,转化大肠杆菌JM109;重组质粒用 BamHI+HindⅢ 酶切及 PCR扩增鉴定。用 Sanger双脱氧链终止法进行 DNA序列测定,应用 DNASIS软件进行同源性比较。结果:RT－PCR扩增获得成囊前期幼虫TspE1基因(871 bp),EcoR I 酶切鉴定正确;筛选出 7个阳性克隆,对目的基因的测序结果显示旋毛虫河南株TspE1基因有5种类型,但都与GenBank中的TspE1基因序列及由其推测的氨基酸序列不完全相同。结论:应用RT－PCR技术扩增出旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码相对分子质量为31 000的抗原结构基因．证实TspE1基因在成囊前期幼虫已有表达,结果还提示旋毛虫河南株可能存在有基因多态性。

旋毛虫p46000抗原基因的转录及表达特性鉴定

根据旋毛虫p46000抗原基因和葡萄糖3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列设计特异引物,以不同发育时期旋毛虫总RNA为模板进行SYBRGreen染料法实时定量RT-PCR检测p46000基因转录情况。制作不同发育时期旋毛虫虫体及感染组织石蜡切片,采用免疫荧光染色技术检测p46000抗原的表达及定位情况。结果显示,p46000抗原基因在旋毛虫不同发育时期均有转录,但转录水平有明显差异,转录高峰集中于成虫和肌幼虫期,新生幼虫期明显低于其他时期。天然p46000抗原蛋白定位于杆状体和虫体表面,表达高峰集中于成虫、肠道期及成囊期肌幼虫。表明,p46000抗原基因的转录与表达具有一定的时空特异性,该基因在旋毛虫的寄生过程中尤其在早期感染中具有重要作用且可能与旋毛虫的免疫逃避有关。

旋毛虫成囊前期幼虫编码31kDa抗原基因的分子克隆及序列分析

目的 克隆旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码 31kDa抗原基因 (TspE1)片段 ,并测定其基因序列 ,以了解该基因序列与已报道虫株的差异。方法 根据TspE1基因已知序列设计合成一对引物 ,采用RT -PCR技术获取旋毛虫成囊前期幼虫目的基因 ,PCR产物经纯化后用BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切 ,定向克隆入pC18质粒 ,转化大肠杆菌JM10 9;重组质粒用BamHⅠ +HindⅢ酶切及PCR扩增鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定 ,应用DNASIS软件进行同源性比较及预测抗原表位。结果 RT -PCR扩增获得成囊前期幼虫TspE1基因 (约 870bp) ,EcoRⅠ酶切鉴定正确 ;筛选出 7个阳性克隆 ,对目的基因的测序结果显示有 5种类型 ,但都与GenBank中的TspE1基因序列及由其推测的氨基酸序列有较高同源性 ,尤其是Ts HN3核苷酸及氨基酸序列同源性分别达 99 6 %和 98 9% ;TspE1基因中可能存在 7个抗原表位。 结论 应用RT -PCR技术扩增出旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码 31kDa抗原结构基因 ,证实TspE1基因在成囊前期幼虫已有表达 ;

旋毛虫T668基因转录及表达的时空特性鉴定

采用RT-PCR和免疫荧光染色技术,分别检测T668基因mRNA及蛋白在旋毛虫不同发育时期中的时空表达情况。RT-PCR结果显示,该基因从旋毛虫新生幼虫出生即开始转录,随着日龄的增加,T668基因mRNA逐渐减少,在感染后11～14 d T668基因的转录趋于停止。免疫荧光染色结果表明,在感染后1d,旋毛虫虫体即有T668蛋白表达;感染后6～13d,T668蛋白分泌到肿大的肌细胞核上;14～20d,肿大的肌细胞核上基本观察不到T668蛋白,但整个虫体仍有很强的蛋白表达。这提示在旋毛虫的寄生过程中,T668基因的转录及表达呈一定的时空特点,这可能对旋毛虫包囊形成有着重要作用。