旋毛虫新生幼虫cDNA文库的免疫筛选

目的 获取具有抗原性的旋毛虫新生幼虫基因。 方法 以旋毛虫感染猪血清为抗体探针 ,对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选 ,将获得的阳性克隆进行测序及分析。 结果 从 4 5× 10 5旋毛虫新生幼虫cDNA文库重组子中共获得 15 8个阳性克隆。序列分析结果表明 ,其中有 3 6个新的cDNA序列 ,已报道的序列有 5个 ,有 12个序列无开放阅读框架 (ORF) ,与旋毛虫线粒体基因组DNA同源。

旋毛虫DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的研究

目的 观察旋毛虫DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答。方法 将旋毛虫肌幼虫编码 31kDa抗原结构基因真核表达质粒pcDNA3-TspE1分别用肌肉注射和基因枪免疫BALB/c小鼠 ,免疫血清用旋毛虫肌幼虫冰冻切片及石蜡切片抗原进行IFAT检测 ,并用旋毛虫肌幼虫可溶性抗原进行Westernblot分析。结果 IFAT表明 pcDNA3-TspE1接种BALB/c小鼠后产生的免疫血清与旋毛虫肌幼虫可产生阳性反应 ,在肌幼虫冰冻及石蜡切片上均显示黄绿色荧光。Westernblot检测结果显示 ,pcDNA3-TspE1接种小鼠后产生的免疫血清只能识别旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中的 31kDa抗原组分 ,而 pcDNA3质粒接种小鼠后的血清不能与旋毛虫肌幼虫可溶性抗原发生免疫反应。结论 旋毛虫DNA疫苗 pcDNA3-TspE1能够诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。

旋毛虫DNA疫苗在中国仓鼠卵巢细胞中的表达(英文)

目的 观察编码旋毛虫相对分子质量 (Mr) 3 10 0 0抗原的DNA疫苗 (重组真核表达质粒pcDNA3 TspE1)在中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞中的体外表达 ,并分析其表达产物的抗原性。 方法 通过用阳离子脂质体Lipofectamine 2 0 0 0将重组质粒pcDNA3 TspE1转染CHO细胞 ,G418筛选阳性克隆 ,用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、间接荧光抗体试验 (I FAT)、十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)对表达产物进行鉴定。 结果 RT PCR结果显示 ,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞在 876bp处有一条带 ,而用空质粒pcDNA3转染的CHO细胞未出现条带 ,表明pcDNA3 TspE1转染细胞中有TspE1基因转录。IFAT结果显示 ,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞与重组融合蛋白免疫小鼠血清反应呈现亮绿色荧光 ,而pcDNA3转染的CHO细胞及未转染细胞呈现橘黄色。Westernblotting显示在pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞培养液中存在有一Mr约 3 10 0 0的蛋白带 ,且该条带能被重组融合蛋白免疫小鼠血清、旋毛虫肌幼虫可溶性抗原免疫兔血清、感染旋毛虫的小鼠及旋毛虫病患者血清识别。 结论 重组质粒pcDNA3 TspE1可转染CHO细胞 ,旋毛虫TspE1基因可在转染的CHO细胞中表达 ,表达蛋白能分泌到细胞培养上清中且具有旋毛虫?

旋毛虫pcDNA3.1/Ts87重组质粒的构建和表达

目的 构建和表达旋毛虫重组质粒。方法 PCR法在旋毛虫抗原基因Ts87两端加上合适的酶切位点和KOZAK序列,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1/Ts87重组质粒。采用Lipofectamine介导的细胞外源DNA转染法,把重组质粒导入COS7细胞。分别用肌肉注射和基因枪免疫小鼠。结果和结论 成功构建pcD-NA3.1/Ts87重组质粒,并在COS7细胞和BALB/c小鼠体内表达。

我国旋毛虫Ts254 DNA探针制备及序列测定

我国云南猪体旋毛虫分离株（ＢＳ）经随意扩增的多态ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）方法产生的２５４ｂｐ条带，以地高辛（ｄｉｇｏｘ－ｉｎｉｎ）标记制成探针（Ｔｓ２５４），将此探针与７株旋毛虫总ＤＮＡ进行斑点杂交，出现明显的杂交斑点，检出的ＤＮＡ量为１ｎｇ。但与其它相关寄生虫、质粒ｐＢＲ３２２、昆明株小鼠肌肉ＤＮＡ均未出现杂交反应，表明Ｔｓ２５４探针具有一定的特异性和较高的敏感性。将此Ｔｓ２５４ＤＮＡ片段克隆进Ｍ１３ｍｐ１８／１９噬菌体，扩增后，筛选阳性重组子，抽提单链后测序。经Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ序列数据库检索，Ｔｓ２５４序列与真核ＤＮＡ及结构ＲＮＡ序列无有意义的同源性，此旋毛虫ＤＮＡ序列为我国首次报道。

应用PCR检测旋毛虫DNA的研究

根据旋毛虫幼虫１．６ｋｂ基因序列而设计合成引物，并进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）以检测含鼠肌肉旋毛虫幼虫及纯幼虫。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，可见扩增出了特异的６７０ｂｐ与５００ｂｐ大小的ＤＮＡ条带，而正常肌肉对照未见扩增出此条带。本法可检测０．０１条幼虫产物。

应用特异性引物检测中国不同地区旋毛虫DNA

根据Ｊｅａｎ－Ｄｕｐｏｕｙ－Ｃａｍｅｒ所报道１．７ｋｂ基因序列而设计合成的引物，对中国九个地区的旋毛虫株的肌组织旋毛虫ＤＮＡ进行了聚合酶链反应（ＰＣＲ）。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见中国猪源旋毛虫均扩增出特异性的６０２ｂｐ和２３０ｂｐ大小的ＤＮＡ条带，而中国犬源和猫源以及正常对照肌组织ＤＮＡ均未扩增出特异性片段。本法对中国猪源旋毛虫可检测到０．０２条旋毛虫ＤＮＡ，具有高度的特异性和敏感性。

抗旋毛虫病Ts87DNA疫苗滴鼻初免-蛋白疫苗加强免疫策略增强免疫保护应答

为优化抗旋毛虫病核酸疫苗免疫策略，本文探讨了Ts87DNA疫苗滴鼻初免与蛋白疫苗皮下注射加强免疫诱导产生的保护效果及免疫应答特征。分别在第0d以旋毛虫Ts87DNA疫苗sL7207／pVAx1-Ts87滴鼻初免，第14／28d以蛋白疫苗rTs87皮下注射加强免疫小鼠，在第35d攻击感染旋毛虫肌幼虫，第84d剖杀小鼠，计算减虫率观察免疫保护效果；进行小鼠血清中特异性IgG抗体效价、抗体亚型分析及肠道盥洗液sIgA水平分析，检测脾淋巴细胞增殖反应、脾及颈部淋巴结细胞分泌细胞因子水平。结果显示，DNA疫苗滴鼻初免一重组蛋白加强的联合免疫组的保护作用优于单独DNA疫苗滴鼻及单独重组蛋白免疫组，显著提高了减虫率（46．1％）；DNA疫苗滴鼻初免和蛋白疫苗加强免疫方式不仅诱导小鼠产生了粘膜免疫应答，同时也诱导了有效的细胞和体液免疫应答，其免疫应答类型是以Th2型为主的混合型Th1／Th2免疫反应。该研究为新型抗旋毛虫病疫苗接种策略的优化提供了实验依据。

我国4个旋毛虫分离株DNA限制性酶切片断长度差异的比较研究

报告我国云南、河南、沈阳（猪）以及长春（犬）４个旋毛虫分离株，用１０种限制性内切酶分析比较其基因组ＤＮＡ酶切片断长度差异。结果表明：来自猪体与来自犬体的旋毛虫酶切图谱不同，显示宿主的不同比地理位置、气候条件差异在旋毛虫的分类上更有意义。

我国7株旋毛虫基因组DNA的研究

对我国７株旋毛虫基因组ＤＮＡ，采用５种限制性内切酶分析表明，来自猪体的旋毛虫酶谱相似，来自犬、猫体的旋毛虫酶谱相似，而猪体与犬、猫体的旋毛虫酶谱差异明显。同时采用随意扩增的多态ＤＮＡ分析，引物为：５＇ＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣ３＇，各分离株显示自己特有带型。比较不同地区猪体或犬、猫体的旋毛虫及同一地区不同宿主的旋毛虫的相似率。提示：地区差异愈大，相似率愈小；宿主亲缘愈远，其相似率愈小。似乎我国旋毛虫可分为两群：一群是猪体旋毛虫，另一群是犬、猫体旋毛虫。

旋毛虫病疫苗研究进展

旋毛虫病是一种由旋毛虫感染而引起的人兽共患病,人因食入生的或未煮熟肉类而患病。该病在世界上广泛分布,从发现至今已有188年的历史。通过肉类制品的传播可能导致旋毛虫病的暴发,从而产生更广泛的社会影响。本文通过梳理近10年的文献,综合分析旋毛虫病疫苗研究进展,为基于疫苗的旋毛虫病防控工作提供参考。

我国首次发现乡土旋毛虫的研究报告

目的 :对我国两株旋毛虫进行虫种归属鉴定。方法 :通过生物学特性的比较研究。结果 :单对虫体杂交试验 ,表明河南猪株与黑龙江犬株存在生殖隔离现象 ;冷冻耐力试验 ,在 - 15℃下 ,前者 9d即死亡 ,后者可存活 1年以上 ;在 4℃ ,前者肌肉期幼虫呈圆盘状卷曲 ,后者呈螺旋状卷曲 ;生殖力指数 ( RCI)在小鼠试验分别为 195.7和 6.2 ( P<0 .0 1) ,在大鼠分别为 191.3和 14.4 ( P<0 .0 1) ;前者对家猪易感 ,后者不易感 ;随机扩增多态性 DNA指纹分析其扩增后产物的 DNA片段电泳带型 ,河南猪株旋毛虫与 T.spiralis基本相同 ,黑龙江犬株旋毛虫与 T.nativa一致。结论 :我国至少存在上述两种旋毛虫 ,即 :河南猪株旋毛虫系 T.spiralis,黑龙江犬株旋毛虫系 T.nativa。

用SSR-PCR和RAPD技术研究中国不同地域旋毛虫株的遗传变异

目的 对中国不同地域的旋毛虫株基因组DNA进行多态性分析 ,并为其种及种下分类提供依据。方法 采用微卫星锚定PCR(SSR PCR)及随机扩增多态性DNA技术 (RAPD)对我国 6旋毛虫株基因组DNA进行PCR扩增 ,根据扩增产物电泳条带情况进行SAS分析 ,计算遗传距离并构建进化树。结果 T3、T7与国内各地域株间遗传距离均大于 0 85 ;湖北株与天津株、黑龙江株与云南株之间的遗传距离均小于 0 2。河南株与前 4株的遗传距离在SSR PCR小于 0 3,在RAPD小于0 6。结论 中国 6株旋毛虫在基因水平可分为不同层次的 3类 :a 湖北株、天津株为一类 ;b 黑龙江株、云南株为一类 ;c 不明株与河南株归为一类或者不明株归为a类中。国内 6株归属于T1。此外 ,国际标准株T3。

旋毛虫河南株TspE1基因克隆及多态性分析

目的:构建旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码相对分子质量为31 000的蛋白抗原结构基因(TspE1)的重组质粒(pUC18－TspE1),测定TspE1基因序列,分析旋毛虫河南株的基因多态性。方法:根据TspE1基因已知序列设计合成一对引物,采用RT-PCR技术获取旋毛虫成囊前期幼虫目的基因,PCR产物经纯化后用BamHI、HindⅢ进行双酶切,定向克隆人 pUC18质粒,转化大肠杆菌JM109;重组质粒用 BamHI+HindⅢ 酶切及 PCR扩增鉴定。用 Sanger双脱氧链终止法进行 DNA序列测定,应用 DNASIS软件进行同源性比较。结果:RT－PCR扩增获得成囊前期幼虫TspE1基因(871 bp),EcoR I 酶切鉴定正确;筛选出 7个阳性克隆,对目的基因的测序结果显示旋毛虫河南株TspE1基因有5种类型,但都与GenBank中的TspE1基因序列及由其推测的氨基酸序列不完全相同。结论:应用RT－PCR技术扩增出旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码相对分子质量为31 000的抗原结构基因．证实TspE1基因在成囊前期幼虫已有表达,结果还提示旋毛虫河南株可能存在有基因多态性。

旋毛虫肌幼虫核酸疫苗的构建及其在小鼠体内的表达

目的 构建和表达旋毛虫肌幼虫编码相对分子质量 (Mr) 3 10 0 0抗原结构基因 (TspE1)的重组质粒。 方法 通过逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)特异性扩增TspE1基因 ,构建重组质粒 pUC18 TspE1,并将TspE1基因亚克隆入真核表达载体 pcDNA3中。用基因枪免疫小鼠 ,通过苏木素 伊红 (HE)染色及免疫组化观察重组质粒在皮肤组织内的表达情况。 结果与结论 成功构建 pcDNA3 TspE1重组质粒 。

旋毛虫成囊前期幼虫编码31kDa抗原基因的分子克隆及序列分析

目的 克隆旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码 31kDa抗原基因 (TspE1)片段 ,并测定其基因序列 ,以了解该基因序列与已报道虫株的差异。方法 根据TspE1基因已知序列设计合成一对引物 ,采用RT -PCR技术获取旋毛虫成囊前期幼虫目的基因 ,PCR产物经纯化后用BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切 ,定向克隆入pC18质粒 ,转化大肠杆菌JM10 9;重组质粒用BamHⅠ +HindⅢ酶切及PCR扩增鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定 ,应用DNASIS软件进行同源性比较及预测抗原表位。结果 RT -PCR扩增获得成囊前期幼虫TspE1基因 (约 870bp) ,EcoRⅠ酶切鉴定正确 ;筛选出 7个阳性克隆 ,对目的基因的测序结果显示有 5种类型 ,但都与GenBank中的TspE1基因序列及由其推测的氨基酸序列有较高同源性 ,尤其是Ts HN3核苷酸及氨基酸序列同源性分别达 99 6 %和 98 9% ;TspE1基因中可能存在 7个抗原表位。 结论 应用RT -PCR技术扩增出旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码 31kDa抗原结构基因 ,证实TspE1基因在成囊前期幼虫已有表达 ;

旋毛虫新生幼虫抗原保护性免疫的研究进展

旋毛虫新生幼虫抗原具有很好的免疫原性,有明显的抗旋毛虫保护性免疫作用。本文介绍了旋毛虫新生幼虫抗原保护性免疫研究的新进展。

用分子生物学技术分析国内六株旋毛虫分离株

本文首次对来自我国不同地区、不同宿主来源有代表性的6个旋毛虫分离株从基因组DNA的限制性酸切长度多态性、同工酶及可溶性蛋白进行综合研究。核酸结果显示：长春株与其余各地域株的限制性酶切困话间存在着差异，用长春株特异性DNA片段（1．12kb）制成探针，与各株DNA进行Southern杂交，发现各虫株的杂交带型不一，且仅长春株出现1．12kb杂交带。同工酶结果显示：长春株与其余各珠在5种同工酶（GPI、G6PD、HK、6PGDH及AK）酶谱中有显著不同。等电聚焦电泳结果显示：长春株具有一条约4.1PI的特异带。上述结果提示：我国6株旋毛虫分离株间存在着差异，长春株与其余各株差异显著，从而推断我国旅毛虫虫株至少存在2种不同的生物学类型，其间的差异主要与不同的地理分布和／或不同宿主来源有关。

从基因水平对新型佐剂在旋毛虫疫苗中免疫调节作用的探讨

目的 从细胞因子的基因转录水平探讨两种新型佐剂霍乱毒素 B亚单位(CT B)和皂素(Saponin)在旋毛虫疫苗中的免疫调节作用。 方法 36只NIH小鼠随机分为CT B佐剂免疫组、Saponin佐剂免疫组和对照组。将CT B和Saponin分别与旋毛虫肌幼虫可溶性抗原混匀后,以口服或皮下注射途径免疫小鼠,隔周1次。第3次免疫后 1 周,经口感染旋毛虫感染期肌幼虫。感染后第8 d,采用RT PCR技术分析各组小鼠脾细胞在体外旋毛虫肌幼虫抗原刺激下,转录细胞因子 IFN γ、IL 2、IL 4及 IL 5 mRNA的水平。 结果 各组小鼠的脾细胞在体外抗原诱导下均未能转录 IL 2和 IFN γmRNA,但均有不同程度的 IL 4和 IL 5特异扩增,两免疫组的 IL 4 及 IL 5 mRNA转录水平明显高于对照组。结论 Th2细胞及其分泌的细胞因子在机体抗旋毛虫的保护性免疫中发挥着重要作用;从佐剂角度提高旋毛虫疫苗的保护性是可行的。

猪旋毛虫病免疫方法的研究

本试验比较了３日龄及７日龄旋毛虫成虫可溶性抗原的免疫原性，比较了不同佐剂对免疫效果的影响，观察了不同免疫途径对免疫效果的影响及疫苗的免疫持续期。结果表明，３日龄及７日龄成虫可溶性抗原免疫猪所诱导产生的免疫力接近，说明免疫原性基本一致。以白油—司班佐剂乳化抗原的免疫效果优于弗氏完全佐剂（ＦＣＡ）乳化抗原，其减虫率分别为８６．３乏％与７０．２２％２而且白油—司班佐剂苗的粘稠度适中，便于注射。免疫途径对免疫效果的影响，以成虫可溶性抗原经腹腔注射（ＩＰ）的免疫效果优于肌肉注射（ＩＭ）。疫苗保存于４℃６个月不影响其免疫效力。猪免疫接种成虫可溶性抗原疫苗后免疫持续期至少６个月。