Synthesis and antifungal activity of trichodermin derivatives

A series of derivatives were synthesized from trichodermin（1） which was an antifungal metabolite produced by Trichoderma taxi sp.nov.Their structures were confirmed by ~1H NMR,MS spectrum.Their antifungal activities were evaluated in vitro.The preliminary structure activity relationships（SAR） results indicated that the double bond,epoxide moiety and ester group were main pharmacophore elements,the stereochemistry of C4 position played a key role as well,and the compounds 1e-1g displayed stronger antifungal activity against Magnaporthe grisea than 1.

枸骨内生真菌抗菌代谢产物的鉴定及活性研究

对一株枸骨内生真菌哈茨木霉Trichoderma harzianum抗菌活性成分的分离、鉴定及其抗菌生物活性进行了研究。该真菌发酵液经乙酸乙酯萃取、正相硅胶和ODS-反相色谱分离纯化得到一单端孢霉烯化合物,经红外、质谱和核磁分析,鉴定为:4β-乙酰基-12,13-环氧-9-单端孢霉烯(trichoderm in),这是首次从哈茨木霉菌代谢产物中分离出该化合物。Trichodermin对蕃茄早疫病和黄瓜立枯病病原菌的离体抑制活性EC50值分别为3.35和3.59mg/L;活体测定结果表明,在100mg/L的剂量下对两种病的保护效果分别为97.8%和98.1%,治疗效果为96.7%和97.3%。

气相色谱-质谱法测定哈茨木霉菌代谢产物中单端孢霉烯化合物的含量

利用气相色谱-质谱法建立了哈茨木霉菌发酵代谢产物中活性有效成分单端孢霉烯化合物含量的分析测定方法。用乙酸乙酯提取样品，并测定提取液中单端孢霉烯化合物的含量，以保留时间和单端孢霉烯化合物的质谱特征离子峰（m／z292、277、149、135、121和107）为定性分析依据，用外标法定量。在所建立的分析条件下，单端孢霉烯化合物的保留时间为8．09min，方法检出限为0．04μg/L；在0．5～50μg／L范围内具有良好的线性关系，相关系数为0．9998；回收率102．3％；RSD为0．86％。方法灵敏度高，选择性好，准确度高，可为哈茨木霉菌菌株改造和发酵生产研究中单端孢霉烯化合物的跟踪检测提供灵敏、准确的分析手段。

枸骨内生菌No.2的鉴定及其对黄瓜立枯病的生防作用

从枸骨植物中分离到一株对立枯丝核菌Rhizoctonia solani具有抑制作用的内生真菌(编号为No.2),借助Biolog微生物自动分析仪对该真菌进行了分类鉴定,根据菌株的生理生化和形态特征,初步确定该菌株为哈茨木霉菌Trichoderma harzianumRifai。双重培养试验表明,该哈茨木霉菌对黄瓜立枯病菌存在竞争和寄生作用;盆栽试验测定结果表明,喷施哈茨木霉菌胞外代谢产物木霉素的1000倍液7d后,其对黄瓜立枯病的保护和治疗效果分别为88.89%和95.83%。施药后各处理对黄瓜的株形、叶色均未产生药害症状,表明其安全性较好。

GC法测定研究发酵液中木霉素

目的建立木霉素的气相色谱含量测定方法。方法色谱柱HP-5弹性石英毛细管柱(以5%苯基甲基硅氧烷为固定液,30 m×320μm,0.25μm);检测器:氢火焰离子检测器(FID);检测器温度270℃;进样口温度250℃;柱温度:程序升温,初始温度100℃,保持5 min,以10℃·min-1升温至260℃保持5 min;载气:氮气;流速1.5 mL·min-1。结果该色谱条件下,木霉素能得到很好的分离,定量法的线性范围为0.01～0.5 g·L-1,平均回收率为99.76%,相对标准偏差为1.69%。结论该气相色谱法测定木霉素准确、可靠;测定方法简单、快速、重复性好。

哈茨木霉发酵产木霉素的培养条件优化

采用快速有效的数学统计方法对一株枸骨内生真菌哈茨木霉生产木霉素的培养条件进行了优化。首先利用Plackett-Burrman设计在影响木霉素产量的6个因素中筛选出主效因素:葡萄糖浓度、发酵时间、接种量。在此基础上,再利用响应面分析法对以上三个显著因子的最佳水平范围进行研究,建立并分析了各因子与木霉素产量关系的回归模型。通过模型确定出最佳的试验条件:葡萄糖浓度42.8g/L,接种量1.39ml和发酵时间102.88h,该条件下木霉素的产量可达147.44mg/L。经五批培养验证,预测值与验证试验平均值接近。

木霉菌素产生菌的诱变育种

[目的]筛选高产木霉菌素菌株,提高木霉菌素产量。[方法]以从枸骨中分离到的产木霉菌素的内生真菌———哈茨木霉为出发菌株,进行紫外线二次复合诱变处理,将筛选出的突变菌株连续转接5代,测定其遗传稳定性。[结果]随着照射时间的延长,哈茨木霉的致死率增大,选取致死率为88.1%的紫外线照射45 s作为最适处理剂量进行诱变育种。经过2次诱变的菌株的产孢时间提前,长出的菌落更为致密。经过初筛和复筛,最终获得1株高产突变株UV-5-3,其产抗生素的水平最高,为164.75μg/m l,比初次诱变筛选获得的突变株UV-3-1提高了56.77%,是出发菌株的2.3倍。传代试验表明,突变株UV-5-3的高产性能遗传特性稳定。[结论]利用紫外线二次复合诱变处理哈茨木霉可以获得高产木霉菌素菌株。

分批发酵和补料分批发酵生产木霉素的研究

为了提高木霉素的发酵产量,以哈茨木霉Trichoderma harzianum Rifai菌株LC2为生产菌,在10L发酵罐中对分批发酵和补料分批发酵工艺进行了研究。结果表明,在分批发酵工艺中,在8%接种量、4L/min通气量和200r/min搅拌转速条件下,发酵72h时木霉素产量达到最大值149.6mg/L。在间歇补料分批发酵工艺中,分6次补料,使培养基中各成分的终浓度与分批发酵相同,木霉素的发酵产量提高到182mg/L,比分批发酵提高21.7%。

脐孢木霉菌Trichoderma brevicompactum 0248 tri5基因片段的克隆及表达分析

脐孢木霉菌Trichoderma brevicompactum能合成木霉素等单端孢霉烯类化合物,而基因tri5编码的单端孢霉二烯合酶是合成途径中的关键酶,它催化反式法呢基焦磷酸(tFPP)合成单端孢霉二烯。为分析基因tri5与木霉素合成的关系,本研究从脐孢木霉菌0248中克隆了基因tri5片段,并运用实时荧光定量PCR技术分析了基因tri5在不产木霉素培养基和产木霉素培养基中的差异表达。在相同培养时间下,基因tri5在不同产木霉素状态间的表达量差异显著;在培养96 h时基因tri5在2种培养基中均达到最大值,基因tri5在产木霉素状态下的表达量是不产木霉素状态下的107.18倍。通过检测产木霉素培养基中基因tri5表达量与木霉素含量的变化,结果显示木霉素的含量随着基因tri5表达量的增加而不断增加,在培养96 h时达到最大值118.71 mg L 1,推测基因tri5表达量与木霉素合成相关。该研究为基因tri5功能的进一步研究和对脐孢木霉菌0248进行基因工程菌改造奠定了理论基础。

高速逆流色谱法从哈茨木霉发酵液中分离纯化抑菌活性成分

本文采用高速逆流色谱法(HSCCC),以正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水=7:3:5:5(v/v/v/v)作为两相溶剂体系,直接从哈茨木霉菌Trichoderma harzianum发酵液的乙酸乙酯提取液中分离出对立枯丝核菌Rhizoctonia solani有抑制作用的主要活性成分,经FTICR质谱及核磁共振鉴定为木霉菌素trichodermin(每324.3 mg的乙酸乙酯提取物中分离得到4 mg),对水稻纹枯病菌Thanatephorus cucmeris菌丝生长毒力EC50及EC90分别为0.69μg.mL 1、3.02μg.mL 1,此方法可用于扩大制备木霉菌素trichodermin。此外高速逆流色谱法还得到了另一对立枯丝核菌Rhizoctonia solani有明显抑制效果的活性混合组分。

木霉素标准样品的研制

目的:依据GB/T15000.3-2008《标准样品工作导则(3)标准样品:定值的一般原则和统计方法》,在国家标准化管理委员会批准立项的基础上,研制木霉素标准样品。方法:以脐孢木霉菌代谢产物为原料,通过提取及硅胶柱层析分离到木霉素纯品,采用紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(MS)和核磁共振(NMR)对其进行结构确认。样品分装成100瓶(10 mg/瓶)后,采用气相色谱法进行了均匀性检验、稳定性检验和联合定值分析。结果:经F检验该样品在95%的置信区间范围内均匀性良好;在-20^-18℃条件下保存12个月稳定性良好;经国内8家具有分析资质的实验室进行协同定值,木霉素纯度定值结果为99.86%,扩展不确定度为0.05%。结论:本研究所得的木霉素达到国家标准样品的技术要求,可用于有关木霉素的检测方法校正和质量控制。

紫杉木霉突变株UL60-11产木霉菌素的发酵条件优化

为了提高紫杉木霉Trichoderma taxi ZJUF0986突变株UL60-11木霉菌素的产量,采用单因素试验筛选出菌株UL60-11生长及产素的最佳碳氮源为葡萄糖、淀粉、蛋白胨、酵母粉、酒石酸铵;通过均匀设计与正交试验相结合优化出最佳培养基配方:葡萄糖23g、淀粉15g、蛋白胨5g、酵母粉3g、酒石酸铵2g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1.0g、氯化钠0.2g、硝酸钙0.4g。在最适工艺条件:初始pH4.0、温度25℃、种龄48h、10%接种量1、00ml/500ml的装液量和150r/min下摇瓶发酵试验,木霉菌素产量达到632.16μg/ml,比优化前提高32%。

木霉菌素的光稳定性及其降解产物分析

为明确木霉菌素的光稳定性及其主要降解产物,分别采用可见光、紫外光、纳米氧化钛(TiO2)、纳米氧化钛加紫外光(TiO2-UV)催化降解等技术,测试了木霉菌素的光稳定性;并采用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析方法,通过与所合成的木霉菌素衍生物进行对照分析,确定了其主要降解产物,同时分析了其降解后活性降低甚至失活的原因。结果表明:可见光、紫外光和纳米TiO2单独作用时对木霉菌素的降解效果均较差,而TiO2-UV的催化降解效果较好;TiO2-UV催化降解24 h后的主要降解产物为木霉菌素衍生物木霉菌醇、12,13-二羟基木霉菌素(M-1)、(12-H,13-OH)-木霉菌素(M-2)及(12-H,13-OH)-木霉菌醇(M-3)。研究表明,木霉菌素具有很强的光稳定性,而采用TiO2-UV的方式可催化降解木霉菌素,其降解产物活性降低甚至失活可能是由于木霉菌素抑制蛋白质合成的关键基团被降解破坏所致。

脐孢木霉菌中tri基因簇的克隆及tri基因在不同产素水平下的表达分析

木霉素(trichodermin)是单端孢霉烯类化合物的一种,其对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用。为分析脐孢木霉菌Trichoderma brevicompactum tri基因簇中各基因与木霉素合成的关系,本研究首先克隆得到了脐孢木霉菌0248的tri基因簇,其全长24793 bp且含有7个开放阅读框。利用实时荧光定量PCR分析基因簇中各基因在产木霉素能力不同的培养基中表达,结果表明,高产素培养基中tri基因表达量在培养40 h时较高,随后的时间里表达量大幅降低。在低产或不产素培养基中,tri基因在培养40 h时表达量远低于其在高产素的培养基中基因表达量,在52 h时表达量有所提高,但在随后的时间里呈下降趋势,即tri基因簇表达量与木霉素的产量呈正相关。该研究为进一步阐明木霉素合成途径中相关基因的功能和提高脐孢木霉菌0248的生物防治效果奠定了基础。

一株防治香蕉枯萎病的短密木霉筛选及代谢物木霉素作用评价

由尖孢镰刀菌古巴专化型热带四号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense tropical race4,FocTR4)引起的香蕉枯萎病(banana Fusarium wilt,BFW)是全世界范围内难以防治的真菌病害,给香蕉产业造成巨大的经济损失。本研究旨在筛选高效拮抗FocTR4的木霉生防菌株,并对其发酵代谢产物进行分离、提纯和鉴定,为香蕉枯萎病的高效生物防治提供重要生防菌株和活性化合物资源。从作物根际土壤中分离出木霉菌株,通过平板对峙培养、发酵液对病原菌孢子萌发及菌丝生长抑制,测试筛选出高效抑制FocTR4的生防木霉菌株;通过构建系统发育树明确生防菌株的分类地位;通过柱色谱法分离纯化菌株发酵液中活性成分,通过核磁共振波谱法(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)解析活性成分的结构;通过香蕉苗感病盆栽实验检测生防木霉菌株对香蕉枯萎病的防治效果。结果表明,本研究筛选到了1株拮抗FocTR4的菌株JSHA-CD-1003,平板对峙抑制率为60.6%;发酵液在24 h内能完全抑制FocTR4孢子萌发,7 d内对FocTR4菌丝生长的抑制率为52.6%;基于内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)和tef1-α基因串联序列构建系统发育树,该菌株鉴定为短密木霉(Trichoderma brevicompactum),通过柱色谱法分离提纯和NMR鉴定单一活性化合物为木霉素(trichodermin),最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为25μg/mL;盆栽生防实验表明,菌株JSHA-CD-1003发酵液对香蕉枯萎病的叶片黄化防治率为47.4%,球茎褐化防治率为52.0%。因此,JSHA-CD-1003通过产生木霉素有效抑制FocTR4孢子萌发和菌丝生长,对FocTR4引起的香蕉枯萎病具有良好的生物防治效果,是一株具有生防潜力的菌株。

1株枸骨内生真菌菌株的分类鉴定及其代谢产物的生防作用研究

从浙江省天目山采集的枸骨中分离筛选到1株内生真菌菌株(编号为No.2),经形态特征、培养特性等方面研究,初步判定该菌株为木霉属真菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。该菌通过液体发酵能产生抗真菌活性的次级代谢产物Trichodermin,抑菌活性结果表明,Trichodermin对9种植物病原真菌菌丝生长和2种植物病原真菌孢子萌发均有不同程度的抑制作用。进一步研究发现,Trichodermin具有很高的热稳定性,在100℃以下抑菌活性趋于稳定。活体测定结果表明,Trichodermin对番茄灰霉病有较好的预防保护作用和治疗作用,在150 mg/L的剂量下对番茄灰霉病的保护效果为98.2%,治疗效果为97.4%。

木霉菌素和嘧霉胺复配剂防治抗药性灰霉病

[目的]由于嘧霉胺作用位点单一,加上连年使用和不合理的提高用药量,许多地区产生了严重的抗药性,为了延长嘧霉胺的使用寿命,降低抗药性和使用成本,研究其复配制剂。[方法]将木霉菌素和嘧霉胺2种作用机制不同的药剂进行复配,通过复配制剂的共毒系数、室内离体试验和盆栽药效评价。[结果]发现木霉菌素与嘧霉胺1∶9进行复配,共毒系数达171.1,盆栽药效比嘧霉胺单一防效高21.4%。[结论]该复配增效明显,具有推广的应用价值。