高加索三叶草花蜜腺发育解剖及小花糖分变化研究

【目的】高加索三叶草是优良的蜜源植物,了解其花蜜腺形态特征、组织结构及其发育规律对认识其小花糖分变化规律和合理利用该植物资源具有重要意义。【方法】取5个发育时期的高加索三叶草小花,石蜡切片观察细胞组织结构,毛细管法和生理试剂盒测定花蜜量和糖分含量。【结果】(1)单个小花的花蜜量为(0.394±0.095)μL,每1 m^(2)草地花蜜量为(4536.93±1319.34)μL。(2)蜜腺位于9枚合生雄蕊的花丝内侧基部,为雄蕊蜜腺。蜜腺组织在整个泌蜜过程中淀粉粒分布有明显的动态变化,属于淀粉型蜜腺。(3)可溶性糖含量在盛花期最高,为7.978 mg/g;可溶性糖各组分中果糖占比最大,超过50%,在小花的整个发育过程中呈逐渐下降趋势;淀粉占全糖含量的81%~82%,其中盛花期最高,为35.173 mg/g。【结论】高加索三叶草花蜜腺属于雄蕊蜜腺,由分泌表皮和泌蜜组织构成。原蜜由花托维管束提供,经泌蜜组织加工成蜜汁,后由表皮的气孔泌出。小花的可溶性糖含量在盛花期最高,其中果糖占比最大。

基于代谢组学的‘蒙农三叶草1号’与结瘤相关的根系代谢物研究

为探究高加索三叶草与根瘤菌互作后根系代谢物的变化,本研究以‘蒙农三叶草1号’高加索三叶草(Trifolium ambiguum Bieb.‘Mengnong No.1’)为试验材料,通过设置接种与不接种根瘤菌处理,观察其结瘤效果,并运用代谢组学技术分析接种根瘤菌后根系代谢产物的变化。结果表明,在接种根瘤菌后,‘蒙农三叶草1号’根系出现结瘤现象,共有249个化合物含量发生显著变化,主要注释在“次生代谢产物生物合成”过程中;共有75个化合物富集在47个通路中,主要富集在“黄酮和黄酮醇的生物合成”和“类黄酮生物合成”过程中。其中有16个差异代谢物在结瘤过程中起重要作用,酮戊二酸、山奈酚、槲皮苷、根皮苷、杨梅素和黄豆黄甙促进了该三叶草结瘤过程,精氨酸促进根瘤的生长。本研究可为后期提高高加索三叶草结瘤效率提供理论参考。

白三叶×高加索三叶草F1代茎段离体培养器官发生的研究

以白三叶Trifoliumrepens×高加索三叶草T.ambiguum未成熟胚离体培养产生的F1代无菌苗的茎段为外植体,进行不定芽途径的直接器官发生培养。筛选适宜的诱导、分化及生根培养基,研究不同质量浓度激素组合对体细胞器官发生的影响,为建立扩繁体系及之后的回交试验奠定基础。结果表明:MS+2,4-D 0.1 mg/L、6-BA2 mg/L为适宜的诱导培养基,MS+NAA0.5 mg/L、6-BA1 mg/L、KT 1 mg/L为适宜的分化培养基,不添加任何激素的1/2 MS培养基为适宜的生根培养基。

高加索三叶草、白三叶及其杂种F_1代的RAPD分析

以高加索三叶草为母本，白二叶为父本，获得杂种F1代植株。利用RAPD技术对亲本及其F1的遗传差异性进行研究，从50个随机引物中筛选出14个适宜引物，共扩增出181个RAPD位点，多态性位点百分率为74．oH，每个引物扩增的条带数平均为3．8～4．8，I）NA片段长度在100t2000bp之间。根据扩增图谱计算表明，F1代与白三叶的遗传相似系数为0．3465，与高加索二叶草的遗传相似系数为0．5842，说明F1代与母本的遗传关系更近或者说F。代表达了更多源于母本的遗传信息。

高加索三叶草青贮饲料的制作及质量变化

将处于果后营养期的高加索三叶草Trifolium ambiguum分别做切短为2、5 cm长和未切短处理,同时进行添加和未添加微生物发酵剂对比试验,共设6个处理,每个处理3次重复。将青贮原料装袋,填满,压实,密封。贮藏45 d后,进行感官评定和营养成分测定。经感官评定,添加发酵剂且切短为2 cm处理效果最好,此时表现为醇香味浓,色黄绿,叶片结构完整良好,霉烂程度低。营养成分分析表明,添加发酵剂且切短为2 cm的粗蛋白(CP)含量达20.25%,中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量比未添加发酵剂且切短为2 cm青贮料中的低。总体来说,高加索三叶草单一高水分青贮效果良好,但添加微生物发酵剂后的品质优于未添加的处理。

施肥对高加索三叶草根系生长的影响

将破除硬实的高加索三叶草种子播种于T型容器中,出苗2周后,剔除弱苗,每个容器中只保留1株供试苗,立即施肥。试验分7个施肥处理,包括单施氮肥(8.60g/m2和4.30g/m22个水平)、单施磷肥(21.50g/m2和10.75g/m2 2个水平)与氮磷混施(氮8.60g/m2+磷21.5 g/m2及氮4.30g/m2+磷10.75g/m22个水平),以不施肥为对照(CK),各处理均设置3次重复。每隔1个月以相同施肥量追肥1次,试验期间共施肥3次。生长460d后,冲洗根系,观测高加索三叶草的根,测量根茎的直径、数量、最大长度及生物量。结果表明,氮肥能够促进高加索三叶草根系的生长,施用磷肥效果不明显,最经济的施氮量为4.30g/m2。

高加索三叶草、白三叶及其杂种F_1的形态学和细胞学研究

为了测定高加索三叶草×白三叶的杂种F1与亲本之间的形态学和细胞学差异,采用定株观测的方法对3个材料的物候期、生长动态及形态特征进行了研究,并对其染色体构型及花粉育性进行了对比分析。结果表明,杂种F1各物候期介于双亲之间,除茎长、小花柄长及花萼长以外,各项形态特征均介于双亲之间;其PMCMⅠ平均染色体构型为9.07Ⅰ+14.33Ⅱ+0.23Ⅲ+0.03Ⅳ,为五倍体,伴有落后染色体及染色体桥,高度不育。

2种三叶草杂种F_1代后代鉴定及核型分析

蒙农三叶草1号与白三叶远缘杂种F1代为高度不育植株，在田间栽植的前2年仅开花，不结实，但是从第3年之后出现结实现象。为了探索F1代的结实机理，试验采用根尖染色体压片技术，对杂种F1代所结种子进行了体细胞染色体鉴定，并对根尖染色体压片条件进行了探索和优化。结果表明，F1代所结种子的体细胞染色体数目在40～48范围内变动,个别细胞中有染色体加倍现象和混倍体现象。杂种F1代体细胞染色体数为40，蒙农三叶草1号为48。6～3植株的种子体细胞染色体数为44，初步确定为杂种F1代与蒙农三叶草1号自然回交所得，其核型公式为：2n=30m＋14sm，属于2A型。

GA3和6-BA对高加索三叶草根蘖芽生长及内源激素含量的影响

为了研究植物生长调节剂赤霉素(GA3)和6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)对高加索三叶草根蘖芽生长发育及内源激素含量的影响,在不同浓度的GA3(0对照、300、600、900和1200 mg·L^-1)和6-BA(0对照、25、50、100和200 mg·L^-1),对其根蘖芽生长后的植株高度、叶片数、叶绿素含量和内源激素含量(地上部分和地下部分)进行测定与分析。结果表明:与对照相比,所有GA3处理均显著增加了株高(P<0.05)。尤其在600 mg·L^-1 GA3处理下,平均株高为21.33 cm(高于对照处理4.12倍)。GA3还促进了叶绿素a的合成,最显著效果是在600 mg·L^-1 GA3处理下,叶绿素a的浓度为0.92 mg·g^-1(高于对照76.92%)(P<0.05)。GA3对叶绿素b含量无显著影响(P>0.05)。在6-BA所有处理浓度下,株高约为对照处理2.6倍,并且对于叶片数,6-BA处理比GA3处理更敏感,在200 mg·L^-1时最多,高于对照2.99倍。6-BA显著促进了叶绿素a和b的积累(P<0.05)。内源激素含量在整个处理浓度下均显示出对外源激素应用的剂量反应。对于地上植物部分,600 mg·L^-1的外源GA3引起内源玉米素(ZT),GA3和生长素(IAA)分别增加约23.84%,55.71%和137.99%,而脱落酸(ABA)减少约44.09%。与对照相比,外源200 mg·L^-16-BA使内源ZT,GA3和IAA含量分别提高了约293.23%,49.71%和49.84%,而ABA降低了约52.48%。对于地下植物部分,内源激素变化与地上部分植物的响应大致相似,明显不同在于外源同样浓度GA3(600 mg·L^-1)和6-BA(200 mg·L^-1)处理引起的ABA降低要少(分别为15.15%和28.26%)。总之,600 mg·L^-1 GA3和200 mg·L^-16-BA是促高加索生长发育的最佳浓度。

IBA和NAA对高加索三叶草种子萌发及根蘖生长的影响

为研究外源激素对高加索三叶草(Trifolium ambiguum)种子萌发和根蘖生长发育的影响和生理作用,本研究设置吲哚丁酸(IBA)和萘乙酸(NAA)两种激素分别对高加索三叶草种子与根蘖进行处理。结果表明,1) NAA浸种处理可以有效提高高加索三叶草种子的发芽力,其中10 mg·L^(–1)的NAA处理效果最显著(P<0.05),发芽率由37%增长到55%,发芽势由38%增长到45%。IBA和NAA浸种均可以显著提高种子活力指数(P<0.05)。2) IBA和NAA处理均会对根蘖芽地上部分的生长有影响。2 000 mg·L^(–1)的IBA处理根蘖植株生长速率最高。1 000 mg·L^(–1)的NAA处理对叶片数量增长最多。3) 2 500 mg·L^(–1)和3 000 mg·L^(–1)的NAA浸泡处理均增加了植株中可溶性糖和淀粉的含量。

不同生育期高加索三叶草的根蘖性状及其内源激素含量

高加索三叶草(Trifolium ambiguum)是豆科三叶草属中唯一具有地下根蘖的多年生牧草,它具有发达的地下根蘖和极强的克隆生长能力。本研究对返青期、分枝期、初花期和盛花期的高加索三叶草地上植株生长,以及地下根蘖性状和其根系不同部位的内源激素含量进行测定。结果表明,1)株丛高度、根蘖分枝数、根蘖株丛数和根蘖幅度均随着生育期的推进而增大,且4个时期株丛高度与根蘖幅度比值均近似为1。2)不同生育期,盛花期时根部激素总含量最高;同一生育期下,不同激素总含量相比,返青期和初花期生长素IAA含量较高,分别为2.88和6.25μg·g–1;分枝期与盛花期脱落酸ABA含量较高,分别为3.75和9.63μg·g–1。3)返青期、分枝期和盛花期膨大无芽部位的赤霉素GA3、IAA和ABA含量均高于膨大有芽部位,种激素协同作用抑制根蘖芽的产生;各部位IAA含量在生育期内呈现“先降低再升高”的趋势,玉米素ZT含量为逐渐升高趋势,膨大有芽部位与水平根的ABA含量则表现为“先升高再降低再升高”的“N”型变化趋势。4)GA3含量与根蘖分枝数、ABA含量与根蘖幅度、根蘖株丛数均呈极显著正相关关系,相关系数分别为0.942、0.899和0.813。这一研究有利于掌握高加索三叶草根蘖性状的发生特征,为研究激素对其根蘖性状发生的调控机制奠定基础。

高加索三叶草、白三叶及其4个杂交后代株系的核型比较

为了培育优良三叶草品种,利用高加索三叶草和白三叶进行人工杂交,得到的F_1代植株移植到田间形成了多个株系。本试验选用了4个结实率较高的F_1代株系(分别命名为4-1、1-10、2-4和3-7)和父母本,利用常规染色体压片法,对其种子发芽后进行核型研究。杂交后代的染色体数均为2n=6x=48,与母本高加索三叶草的染色体数相同;杂交后代与亲本的核型类型都为1A型,但核型组成存在一定的差异;核型不对称性由高到低依次为白三叶>4-1>1-10>2-4>3-7>高加索三叶草。试验结果表明,杂交后代株系形态上的差异,不是由染色体数目决定的,而是由核型的不同造成的。

高加索三叶草SSR序列特征分析

为获得高加索三叶草转录组特征,对高加索三叶草的根茎系统进行三代转录组测序,检测到79424条Unigene,序列总长为167351.88 kb,进一步分析得到48235个SSR位点,平均3.47 kb出现一个SSR。高加索三叶草转录组的SSR类型丰富,其中单核苷酸和三核苷酸重复SSR数量最多,分别占SSR总数的45.8%和22.6%,其次是复杂SSR序列占比为15.2%、二核苷酸重复占比为12.8%、四核苷酸重复占比为2.1%、六核苷酸重复占比为0.9%和五核苷酸重复占比为0.6%。本研究对高加索三叶草转录组数据SSR位点信息进行分析,为三叶草属种质资源鉴定和分子标记辅助育种提供更多的标记资源。