四株鳖源致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的表型、分子鉴定及其毒力基因检测

采用生态毒理学、表观分类学及分子生物学方法,对具白底板病典型症状濒死中华鳖内脏中分离获得的4株病原菌开展了以致病性、表型分析、分子鉴定及毒力基因检测为内容的实验研究,结果表明:(1)4株病原菌均具致病性,致死力由大到小依次为ZHYYZ-2、ZHYYZ-4、ZHYYZ-1、ZHYYZ-3;(2)4株病原菌均为呈短杆状、具溶血活性的革兰氏阴性细菌,VITEK2型全自动细菌鉴定与药敏系统和ATBExpression型细菌鉴定与药敏智能系统均显示为嗜水气单胞菌;(3)ZHYYZ-1、ZHYYZ-2、ZHYYZ-3、ZHYYZ-4的16SrDNA序列长度分别为1460、1464、1466、1461,经Blast同源性检索表明它们所扩增的16SrDNA序列与GenBank数据库中登记的71株嗜水气单胞菌的相似性均为99%;(4)经PCR特异性检测,各实验菌均含有Aha、AHH、AerA和OMP。根据4株实验菌的表型和分子生物学特征,判定它们均为气单胞菌属的致病性嗜水气单胞菌。

注射鳖源致病性嗜水气单胞菌ZHYYZ-1引发中华鳖(Trionyx sinensis)稚鳖感染和致死的定量研究

以20日龄中华鳖稚鳖为实验动物,采用静水停食实验法,在水温(27.4±1.3)℃、pH7.1条件下,进行了注射鳖源嗜水气单胞菌ZHYYZ-1引发中华鳖稚鳖感染和致死的定量实验研究。结果表明:(1)该菌为高致病性菌株,异常排泄是该菌致稚鳖表露临床感染症状的重要标志;(2)注射该菌引起稚鳖感染与致死具明显的剂量—时间效应,随注射菌量递增依次出现不表露临床感染症状、表露临床感染症状而不出现死亡和大量死亡三种情形,稚鳖表露临床感染和出现死亡的时间均随注射菌量增大而明显缩短,绝大多数稚鳖表露临床感染和出现死亡的时限分别为2h和48h;(3)濒死稚鳖体内该菌的底限含量为3.3×106CFU/g,稚鳖体内菌注射含量可控安全范围为(1.2—8.8)×103CFU/g。

中华鳖(Trionyx sinensis)稚鳖“白点病”的病原菌及其防治的研究

从患“白点病”的病鳖体中分离到四株菌，经人工感染试验，仅一株菌对健康稚鳖表现出较强的致病力。对该菌的形态特征、培养特性和生理、生化反应的鉴定认为：该病原菌是嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）应用药敏纸片法研究了２０种化学疗剂对该病原菌的生长抑制作用，结果表明：环丙沙星、氟哌酸、庆大霉素、痢特灵等对病原菌具较强抑制作用，而复方新诺明、头孢拉定、呋喃妥因、麦迪霉素、氨苄青霉素等无抑菌作用．在此基础上进行了药物疗效试验。

一例中华鳖腮腺炎的诊断与防治

2021年5月,浙江诸暨某中华鳖养殖场中华鳖脖子肿胀、伸长,底板出现多处血点,并伴随大量死亡,经解剖可见腮部糜烂、充血明显,内脏呈现不同程度病变。从病鳖腮、肝、脾、肾、肠等组织分离纯化病原菌,经形态观察、生化鉴定确定其种属,并采用微量肉汤连续稀释法确定8种国标渔药对其最低抑菌浓度;同时,利用PCR方法检验是否存在病毒感染。结果显示:自有典型临床症状的中华鳖组织中分离到嗜水气单胞菌。药敏试验结果表明,该菌对恩诺沙星、硫酸新霉素和盐酸多西环素3种抗菌药物敏感。同时,在患病中华鳖内脏中检测到一种病毒,通过测序与构建系统进化树发现该病毒与中华鳖出血性综合征病毒同源性最高且聚为一支。病原回归感染试验结果表明,分离的嗜水气单胞菌与病毒均可引起中华鳖不同程度死亡。该例中华鳖腮腺炎为嗜水气单胞菌与出血性综合征病毒混合感染所致。该研究可为中华鳖腮腺炎的科学诊断与防控提供理论依据。

黄沙鳖白底板病病原菌的分离鉴定及6种毒力基因检测

用常规方法从患典型白底板病黄沙鳖的心脏、肝脏等处进行细菌的接种分离,通过人工感染确定分离菌株的致病性,API 20NE、16S rRNA基因序列分析进行病原菌鉴定和确定其系统发育地位,K-B纸片扩散法进行药敏试验,PCR检测病原菌的6种毒力基因。试验结果,共分离到13株病原菌,其中嗜水气单胞菌9株,温和气单胞菌4株。在9株嗜水气单胞菌中,有5株与Aeromonas hydrophila ATCC 7966菌株亲源关系最近,4株与Aeromonas hydrophila北京株QDC01的亲源关系最近;而4株温和气单胞菌与Aeromonas sobria ATCC43979的亲源关系最近。药敏试验结果,仅头孢哌酮对13株病原菌都高度敏感,来源于不同养殖区域的病原菌药敏结果相差较大。6种毒力基因的阳性率,Aer、Act和ahp均为100%,hly和Alt为92.31%,ahal为76.92%;毒力基因型共有4种,嗜水气单胞菌主要为hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+基因型,而温和气单胞菌主要为hly+Aer+Alt-Act+ahal+ahp+基因型,同时携带hly基因的菌株其致病力更强。

黄沙鳖源嗜水气单胞菌的致病力与毒力基因型相关性

为探明黄沙鳖(Truogx sinensis)源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)所携带毒力基因种类对其致病力的影响,以从广西各地患病黄沙鳖中分离得到的嗜水气单胞菌为材料,通过对黄沙鳖和小鼠进行人工感染测定试验菌株的致病力,PCR检测供试菌株的hly、Aer、Alt、Act、ahal和ahp 6种毒力基因。结果表明,47株黄沙鳖源嗜水气单胞菌共包含9种毒力基因型,48.94%的菌株携带全部6种毒力基因,基因型为hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+,是主要的毒力基因型;95.79%的菌株携带hly基因,均为有毒株;嗜水气单胞菌对黄沙鳖的致病力是多个毒力基因共同作用的结果,hly和Act是重要的毒力基因,Alt和ahal基因对菌株的致病力与其他毒力基因之间存在协同作用,ahp基因缺失对菌株的致病力无影响;将对黄沙鳖的致死率达到和超过50%的菌株判定为强毒株,致死率不足50%判定为弱毒株时,强毒株至少携带4种毒力基因,并同时携带有hly和Act基因,弱毒株只携带包括hly在内的2种或3种毒力基因,本研究首次发现只携带Alt和ahal 2种毒力基因的菌株对黄沙鳖和小鼠均无致病力;在所检测的6种毒力基因中,较易缺失的基因主要有Alt、ahal和ahp;在有毒株中,不同基因型的菌株对黄沙鳖和对小鼠的平均致死率差异均为极显著(P<0.01),当存在基因缺失现象时,同一基因型的菌株对黄沙鳖的平均致死率也极显著高于对小鼠的致死率(P<0.01),表明黄沙鳖源嗜水气单胞菌对黄沙鳖的致病力显著强于对小鼠的致病力。根据本研究结果,可将hly基因作为嗜水气单胞菌有毒株的鉴定标准,携带hly和Act基因并同时携带Aer、Alt、ahal、ahp中的2种或2种以上毒力基因作为强毒株的鉴定标准。

嗜水气单胞菌对中华鳖致病力的研究

嗜水气单胞菌菌株Ｔ３、４０１４２Ｇ，５１６１３－１，７０６Ｃ，ＲＴＬ５３１，Ｒ４０２Ｌ，ＲＫ１１１９等分别从患有红底板、腐皮、洞穴及其它症状的病鳖中分离。银鲫对Ｔ３与４０１４２Ｇ的易感性最强，而中华鳖（与小白鼠、青蛙等一样）稍差。各嗜水气单胞菌菌株中，Ｔ３的致病力最强，其致病性随水温升高而增强，随其连续传代而减弱。该菌在用橡皮塞密封的试管中４℃存放时，４００ｄ内致病力基本保持稳定。

黄沙鳖红底板病病原菌的分离鉴定及其毒力基因检测

以常规方法从患典型红底板病黄沙鳖的心脏、肝脏和腹水等处分离到5株病原菌,API 20NE、16S rRNA基因序列分析进行病原菌鉴定和确定其系统发育地位,PCR检测病原菌的6种毒力基因。结果表明,5株病原菌均为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),与Aeromonas hydrophila QDC01菌株的亲源关系最近。6种毒力基因的阳性率,hly、Aer和Act为100%,ahal、Alt和ahp为80%;毒力基因型共3种,在5株菌株中的分布情况为hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+3株,hly+Aer+Alt-Act+ahal+ahp-1株,hly+Aer+Alt+Act+ahal-ahp+1株。试验所检测的5株嗜水气单胞菌的毒力基因型主要为hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+,Alt、ahp和ahal基因的缺失对嗜水气单胞菌的致病力没有影响。

鳖嗜水气单胞菌败血症的研究

将病鳖进行细菌分离，获得的菌株经细菌学鉴定，致病菌为嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）。病鳖食欲减退以至不吃食，反应迟钝；颈部充血，腹甲严重充血，甚至出血、溃疡，体表可见形成的疤痕；口腔、舌尖和鼻孔充血，甚至口、鼻孔中流出血水；肝脏、肾脏、脾脏肿大，有坏死病灶。组织病理观察表明：大量细菌侵入肺、肾、脾、血液、心脏和肌肉等器官组织，造成出血以及全身性组织损害，组织细胞出现肿胀、颗粒变性、玻璃样变和坏死崩解；血管壁严重受损，内皮细胞坏死脱落。血管内以及器官组织血液中大量红细胞变形、碎裂、溶解，呈现溶血性贫血，血液中白细胞数量极少，病变区无白细胞浸润现象。病鳖由于血细胞广泛受损、心脏病变、肺组织严重坏死，影响气体交换，最终因呼吸困难而窒息死亡。肝、肾和脾等器官组织坏死，失去应有的功能，更加速病鳖的死亡进程。疾病的病理变化表明本病为败血症。鳖病的治疗方法：重病鳖体表病灶处涂抹鱼泰８号药，后腿肌肉注射治鳖灵２号药以及轻病鳖口服治鳖灵１号药，并改善水环境等措施后，治愈率在９０％以上。此外。

中华鳖暴发性传染病研究 Ⅲ.嗜水气单胞菌感染症的血液生化和细胞病理

对患嗜水气单胞菌感染症的中华鳖的血液生化和细胞病理进行了检测。病鳖的内脏发生器质性病变,出血、充血,为败血症。病鳖血清的18项指标中有14项明显不同于健康鳖,其中谷草转氨酶(AST)、谷酰氨转肽酶(GGT)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(CREAT)、尿酸(UA)、尿素氮(UN)活性显著增加,而乳酸脱氢酶(LD)、淀粉酶(AMS)、碱性磷酸酶(ALP)、甘油三脂(TRIG)、胆固醇(CHOL)等活性大大降低。肝、肠等脏器细胞坏死,细胞核和细胞膜破裂,髓样结构增多或严重液泡化。用疫苗对中华鳖进行免疫可有效预防嗜水气单胞菌感染症。

特异性卵黄抗体添加剂对中华鳖摄食和生长的影响

中华鳖（Trionyx sinensis）是我国和东南亚地区的主要特种水产养殖品种之一。浙江省是开展中华鳖工厂化养殖较早的地区。目前约占全国产量的60％以上。但随着集约化程度的提高，水质恶化等因素，导致其免疫机能衰退，疾病发生日趋严重，阻碍了养鳖业的进一步发展。其中以嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）引起的中华鳖出血性败血症尤为严重。传统上主要依靠抗生素、含氯剂等药物防治该病，虽能在一定程度上起到防治作用，但是随着药物大量、长期的使用会造成环境污染、细菌耐药性和药物残留的产生。

中华鳖疖疮、红脖子、赤斑病并发症的病原研究

从患疖疮、红脖子、赤斑病并发症的病鳖肝脏分离到多株细菌，其中一株经人工感染证实为病原菌，又经３０ 多项形态、生理、生化特性测试，鉴定为嗜水气单胞菌，其主要特性为短杆状（０ ．３６ ～０ ．７１μｍ ×１ ．０ ～１ ．４μｍ） ，革兰氏阴性，极端单鞭毛，无荚膜，不产生芽孢，具运动性，ＯＮＰＧ反应、精氨酸双水解酶、吲哚、Ｖ－ Ｐ 反应、明胶酶、氧化酶、七叶灵均阳性，发酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖和Ｄ－ 阿拉伯糖产酸，赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、柠檬酸盐利用、Ｈ２Ｓ、脲酶、吲哚丙酮酸（ＩＰＡ） 均阴性。对银鲫的ＬＤ５０ 为９ ．１７ ×１０５ ＣＦＵ 尾，对小白鼠的ＬＤ５０ 为１ ．５９ ×１０７ ＣＦＵ 只。生长最适温度、盐度和ｐＨ 值范围分别为２５ ℃～３５ ℃、５ ～１５ 、６ ．５ ～７ ．５ 。对环丙沙星、氟嗪酸、丁胺卡那霉素、氯霉素、强力霉素、四环素、卡那霉素、氨曲南、乙基西羧霉素、头孢呋新、氧哌嗪青霉素、头孢噻肟、头孢三嗪。

嗜水气单胞菌感染的中华鳖主要器官差减cDNA文库的构建

以致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)人工感染的中华鳖(Trionyx sinensis)肝、脾、肾组织为材料,应用抑制性差减杂交(SSH)技术,构建了嗜水气单胞菌感染组织的差减cDNA文库。以中华鳖管家基因-βactin作为差减指标检测该文库差减效率达210倍,表明感染细菌后某些差异表达基因得到了相应倍数的富集。将获得的cDNA片段连接到pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。PCR阳性检测显示差减片段在150—800bp之间。该差减cDNA文库的构建为快速分离和鉴定中华鳖与细菌感染相关的免疫基因及从分子水平探讨中华鳖的病理和抗感染免疫机制奠定了基础。

中华鳖源嗜水气单胞菌的研究进展

中华鳖（Trionyx sinensis）肉质鲜美,营养丰富,是我国珍贵的淡水名特优水产动物之一。我国中华鳖产量一直居世界产量之首。但近几年中华鳖病原性疾病大量爆发,给我国龟鳖养殖业造成了重大损失。在已经报道的25种中华鳌疾病中,由嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）引起的有15种,如红脖子病、腮腺炎病、红底板病、白底板病、腐皮病、疖疮病、穿孔病、烂甲病等[1]。

中华鳖腐皮病的病原鉴定与药敏试验

为了确定中华鳖(Trionyx sinensis)腐皮病的主要致病菌,从湖南省湘阴县中华鳖养殖场采取已呈明显发病症状且频死的中华鳖10只,从背甲和腹甲病灶处分离到6株菌株,通过分离纯化培养,挑选出2株优势菌株,经形态特征、生理生化特性和人工感染试验,鉴定为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和产碱杆菌(Bacillus al-caligenes)。药敏试验结果表明,这2种致病菌均对青霉素、红霉素、卡那霉素、庆大霉素、丙氟哌酸等抗生素高度敏感,可作为治疗该病的推荐药物。

中华鳖嗜水气单胞菌感染的病理学观察

通过微生物方法确定为嗜水气单胞菌感染的１１０例中华鳖自然病例，采用病理学方法进行研究．结果表明：以鳖红脖子为主的急性败血症病型，其肉眼病变以肝和肾肿大、出血，消化道严重出血、水肿，鳃状组织出血、坏死为主要变化；显微病变以全身各主要器官的细胞广泛性破坏，出血，溶血为特征；实质器官中以肝细胞被破坏最为严重，表现肝细胞空泡变性，细胞破碎、消失，有的只剩下肝组织结构的网状支架．

中华鳖MyD88部分序列克隆及其在组织中的表达差异分析

MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)是多数TLRs(Toll like receptor,TLRs)信号转导过程中的关键接头分子。研究根据MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)TIR结构域(Toll-like/IL-1 receptor domain)保守区设计简并引物,通过PCR扩增,成功地从中华鳖脾脏cDNA中扩增出351bp的目标序列。测序后经结构域和序列比较分析,扩增片段为中华鳖的MyD88 TIR结构域。该序列与大黄鱼、鸡等脊椎动物的MyD88的TIR结构域序列同源性和相似性分别为72.9%～86%和77.6%～83.6%。以热灭活嗜水气单胞菌刺激中华鳖后,经荧光定量PCR检测,在48h内,肝、脾和肾组织中MyD88 mRNA相对表达量均出现不同程度的增加,尤以脾脏中的增幅最为明显,为对照组的6.89倍;中华鳖心脏成纤维样细胞经20ng LPS刺激后1～8h,MyD88表达量有所提高,24h的表达量最高。该研究结果将为开展中华鳖天然免疫奠定良好基础。

中华鳖红脖子、红底板病的病原分离鉴定

为检测广东某鳖场大批死亡的以红脖子、红底板败血型为主要特征的甲鱼 ,对病死甲鱼进行了病原分离与鉴定。采用现场用抗嗜水气单胞菌血清与病死鳖血液作血清学直接凝集反应 ,另外对病死甲鱼进行细菌、病毒分离鉴定。结果表明 ,血清学直接凝集反应为阳性 ,自同一病例中既分离到细菌——嗜水气单胞菌 ,又分离到病毒—类副黏病毒。该菌对小鼠的LD50 为 3 .5× 10 5CFU。病鳖组织滤液接种 8日龄 SPF鸡胚卵黄囊 ,自 F3 开始羊水有血球凝集现象。滤液及 F3羊水经超速离心作电镜样品观察 ,都有多形态带囊膜的类副黏病毒。细菌、病毒相继人工感染甲鱼 ,结果发现病毒不致死甲鱼 。

中华鳖“腐皮病”病原的研究

对江苏省吴县、吴江等地区养殖的患“腐皮病”的中华鳖的病原进行了分离 ,从病鳖的肝脏分离得菌株 B- 1,用菌株B- 1进行人工感染 ,10 0 %的鳖患病 ,出现与自然病鳖相同的症状。对 B- 1株进行菌体形态特征、培养特性、生理生化反应及致病因子检测 。

鳖池水体中优势菌的初步研究

对各种养鳖池中的水体进行细菌分离,共获得四种优势菌,经细菌学鉴定分别为嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、温和气单胞菌(A.sobria)、豚鼠气单胞菌(A.caviae)和费氏枸椽酸杆菌(Citrobacterfreundii)。各水体中均存在此四种优势菌,且其对小鼠的毒力反应一致,24h内供试小鼠全部死亡。此四菌株亦可诱发中华鳖发病死亡,当感染菌数为5×107个/只,7d内幼鳖发病死亡率达100%。