耐盐小偃麦乙烯受体基因TtETR1克隆及表达特性分析

【目的】克隆耐盐小偃麦的乙烯受体基因TtETR1,并进行表达特性分析,为TtETR1基因的功能分析和小麦耐盐遗传育种提供理论参考。【方法】以耐盐八倍体小偃麦为材料,根据小偃麦转录组数据筛选盐胁迫响应关键基因TtETR1,利用同源克隆技术获得其cDNA序列,利用生物信息学软件进行分析,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在盐胁迫下的表达特性。【结果】TtETR1基因的开放阅读框(ORF)长度为2310 bp,编码769个氨基酸残基,其上游2000 bp启动子包含茉莉酸甲酯与脱落酸信号响应、干旱和厌氧诱导、分生组织表达等作用元件。TtETR1蛋白分子质量为85.76 kD,理论等电点(pI)为6.22,为含跨膜结构的分泌型蛋白,定位于细胞质膜上,二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲构成,含有REC_ETR-like、HATPase_ETR2_ERS2-EIN4-like、cGMP磷酸二酯酶-腺苷酸环化酶-FhlA(GAF)、组氨酸激酶(HisKA)等结构域,具有丝氨酸为主、苏氨酸为辅的乙烯信号转导进行磷酸化修饰与调控的位点。盐胁迫下TtETR1基因在根中的相对表达量最高,分别是茎和叶的1.6和2.8倍,且显著高于未盐胁迫处理(对照)(P<0.05),但恢复处理后,TtETR1基因的相对表达量迅速下降至对照水平,与转录组数据分析结果一致。【结论】TtETR1基因在根系中受盐胁迫诱导高效表达,从而提高植物的耐盐性。

盐胁迫下小偃麦酵母双杂交文库构建及TtLEA2-1互作蛋白筛选

【目的】构建小偃麦酵母双杂交(Y2H)文库,筛选胚胎发育晚期丰富蛋白(TtLEA2-1)的互作蛋白,为探究该基因的功能和表达调控机理提供理论参考。【方法】以小偃麦Y1805为材料,经提取RNA、分离mRNA、cDNA合成和均一化(DSN)处理后进行BP(attB和attP位点)重组反应,把重组产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,构建cDNA初级文库。抽提初级文库质粒,以pGADT7-DEST载体进行LR(attL或attR位点)重组反应,再转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,构建Y2H文库。【结果】对初级文库和Y2H文库进行质量分析,其滴度分别是3.98×10^(6) CFU/mL和6.14×10^(6) CFU/mL,库容量分别为7.96×10^(6) CFU和1.23×10^(7) CFU,重组率均为100%。从Y2H文库中挑取的24个单克隆的插入片段长度为850~4000 bp,平均片段长度大于1000 bp。采用Y2H技术和回转验证试验,从小偃麦Y2H文库中筛选了48个可能与TtLEA2-1互作的蛋白。48个TtLEA2-1互作蛋白中,有7个互作蛋白富集在遗传信息处理通路,4个蛋白富集在蛋白质家族:遗传信息过程通路,4个蛋白富集在核苷酸代谢通路,3个蛋白富集在甘氨酸生物合成和代谢通路,2个蛋白富集在碳水化合物代谢通路;富集在蛋白质家族:代谢、细胞过程、环境信息处理、氨基酸代谢通路的蛋白各有1个。【结论】构建的Y2H文库质量高、完整性好和覆盖面广,成功用于小偃麦盐胁迫响应基因互作蛋白的筛选试验,也为新基因发掘及其表达调控机理研究提供高效、便捷途径。

小偃麦衍生系表型遗传多样性分析及综合评价

偃麦草作为小麦的三级基因库,是公认的遗传变异来源,八倍体小偃麦及其衍生的种质材料在提高小麦的遗传多样性及其抗病、品质等性状的改良上发挥了重要作用。对源于中间偃麦草和长穗偃麦草的163份小偃麦衍生系的13个农艺性状进行了多样性分析、相关分析、聚类分析、主成分分析及综合评价,结果表明:供试的小偃麦衍生系中,5个描述性质量性状的多样性指数为0.26~1.00,株型的多样性指数最高;8个产量相关性状的变异系数为4.44%~20.11%,单株产量变异最大(20.11%),其次是有效分蘖数(17.37%)和千粒重(17.13%),抽穗期最小(4.44%);多样性指数为1.97~2.09,千粒重的变异类型最为丰富(H’=2.09),其次是每穗小穗数(H’=2.07),抽穗期的多样性最低(H’=1.97);相关分析表明,不同产量性状之间相互关联;基于8个产量性状欧氏距离的系统聚类分析表明,163份衍生系被划分为6个类群,各群之间差异明显,其中第I、Ⅲ类群为产量性状优异种质;主成分分析表明,前4个主成分代表了163份衍生系81.12%的遗传信息量,分别以千粒重、每穗小穗数、穗长和株高载荷较大,对产量提高有正向效应;根据综合评价D值筛选出排名前5的优异大粒种质为CH16353、CH1742、CH16370、CH16385和CH16382。上述结果说明小偃麦衍生系存在丰富的遗传多样性,可为小偃麦种质用于小麦遗传育种提供重要的参考依据。

小偃麦衍生系CH984抗白粉病基因定位

小麦种质CH984为八倍体小偃麦TAI7047与小麦品种‘晋太170’杂交后代衍生而来的高代选系,在成株期对中国白粉病菌株E09表现免疫,抗病表现与TAI7047相似。将CH984分别与小麦感病材料TC29和SY95-71配置组合,获得CH984/TC29 RIL群体和CH984/SY95-71 F2群体。利用E09对2个遗传群体进行苗期接种鉴定和遗传分析,证实CH984携带1个主效抗白粉病基因,暂命名为PmCH984。采用分离群体分组分析法对CH984/TC29 RIL群体家系的抗感池扫描小麦90K芯片,结果显示多态性SNP标记主要位于小麦2D染色体长臂400~450 Mb区段。在目标区段内每隔5 Mb开发1个SSR标记,并结合2DL染色体上的公共SSR标记和NRM标记扩增CH984/TC29 RIL群体,最终利用8个SSR标记将PmCH984定位在1个40 Mb的物理区间内,与侧翼连锁标记Xcfd2和SSR3的遗传距离分别为2.5和0.1 cM。位点分析表明,PmCH984是一个新的抗白粉病基因。