人肝细胞生长因子mRNA实时荧光PCR定量标准的构建

目的:构建实时荧光定量PCR标准品以定量检测人肝细胞生长因子mRNA的表达。方法:以Trizol裂解抽提法提取新鲜肝组织总RNA。以RT-PCR法制备HGF cDNA目的片段并进行扩增;以A—T载体克隆法将纯化的目的片段与pGEM—T Easy Vector连接成重组质粒并转化E. coli DH5_α。采用碱裂解法提取重组质粒,联合用直接PCR、α互补法和氨苄青霉素筛选法、EcoR Ⅰ限制性酶切和序列分析法鉴定其特异性。用聚乙二醇沉淀法纯化质粒并检测λ260nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备FQ—PCR梯度浓度标准品。结果:HGF cDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性。结论:成功构建了实时荧光PCR定量标准。