TRPV6基因沉默对蛋鸡十二指肠和空肠钙离子跨细胞转运相关蛋白表达的影响

本试验旨在研究瞬时性受体电位通道香草酸受体6(transient receptor potential vanilloid receptor 6,TRPV6)基因沉默对蛋鸡十二指肠和空肠跨细胞钙离子转运相关蛋白表达、血浆钙磷浓度、PTH水平及骨密度的影响。将64只220日龄高产蛋鸡随机分为对照组和TRPV6基因沉默组,分别一次性注射生理盐水和pSIRENTRPV6-3质粒,连续观察28d。结果表明,与对照组相比,pSIREN-TRPV6-3质粒注射第7、14和21天,十二指肠和空肠中均检测到ZsGreen蛋白表达;TRPV6、CaBP-D28K mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01);血浆PTH浓度显著升高(P<0.05或P<0.01);此外,血浆钙、磷浓度不受影响,股骨和胫骨骨密度有降低趋势,但与对照组相比差异不显著(P>0.05)。由此可见,siRNA TRPV6质粒抑制十二指肠和空肠TRPV6和CaBP-D28K的表达,但不影响血液中钙离子浓度和骨密度水平,表明在正常日粮钙水平条件,沉默TRPV6通道蛋白不影响蛋鸡体内正常的钙转运。

钙通道TRPV6基因在子宫内膜癌表达及其临床意义的初步研究

目的:研究TRPV6在子宫内膜癌组织的表达及其与临床病理特征的关系。方法:选取58例子宫内膜癌石蜡切片,用免疫组化法测定TRPV6的分布及表达,分析其与临床病理之间的关系;另取31例正常子宫内膜及13例不典型增生内膜石蜡切片为对照。选取15例子宫内膜腺癌及11例正常子宫内膜新鲜组织标本,以实时定量PCR方法检测TRPV6的表达。结果:(1)TRPV6在子宫内膜癌组织的表达主要位于胞膜及胞浆内,阳性表达率77.6%,显著低于非绝经期子宫内膜组织(100%)及不典型增生子宫内膜组织(100%)(P<0.05),且前者表达强度显著低于后二者(P<0.01)。mRNA水平研究表明TRPV6在内膜癌组织中的表达也显著低于正常内膜组织(P<0.05);(2)绝经后子宫内膜癌患者TRPV6阳性表达率为71.8%,显著低于未绝经患者(89.5%);(3)在子宫内膜癌组织中,宫颈受累者TRPV6阳性率显著高于宫颈未受累者(89.3%vs 67.7%,P=0.039)。结论:TRPV6在子宫内膜癌组织的表达低于正常子宫内膜组织,TRPV6阳性表达者较多发生子宫内膜癌宫颈受侵,表明钙通道蛋白TRPV6与子宫内膜癌有一定的关系,为探讨子宫内膜癌发病分子机制提供了研究资料。

鸭TRPV6和SLC4A4基因SNPs对蛋壳品质的影响

试验旨在探究三穗鸭TRPV6基因和SLC4A4基因SNPs突变对蛋壳品质的影响,筛选出与蛋壳品质相关的分子标记。利用PCR扩增和直接测序法相结合的方法检测鸭TRPV6基因和SLC4A4基因的SNPs,并与蛋壳品质进行关联分析。结果显示:在TRPV6基因第2内含子发现的g.81465153 C>G和g.81465176A>G突变分别对蛋壳重和蛋重有显著影响,在第3外显子发现同义突变g.81465450 T>C;3个SNPs联合产生5种单倍型和7种双倍型,位点联合对蛋壳重有显著影响。在SLC4A4基因第24外显子发现同义突变位点g.15125097 C>T,在内含子25发现g.15132523 G>A突变对蛋形指数有极显著影响,在内含子26发现g.15135079G>A突变;3个SNPs联合产生4种单倍型和7种双倍型,位点联合对蛋壳重有极显著影响。2个基因聚合后6个SNPs联合产生8种单倍型和7种双倍型,位点联合对蛋壳重和蛋重均有显著影响。表明TRPV6基因和SLC4A4基因新发现的3个SNPs联合和2个基因的6个SNPs联合均对蛋重和蛋壳重有显著效应,可作为鸭蛋壳品质选择的遗传标记。

瞬时性受体电位通道香草酸受体亚型6基因敲除小鼠模型的建立

目的建立瞬时性受体电位通道香草酸受体亚型6(Trpv6)基因敲除小鼠模型,为在体研究Trpv6的生物学功能及其与骨代谢关系奠定基础。方法从Ensembl数据库中获得小鼠Trpv6基因组序列。设计基因敲除策略,构建基因敲除载体pBR322-MK-Trpv6。以电穿孔方法将基因敲除载体导入胚胎多能干细胞(ES细胞),用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得双抗性克隆。PCR鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆。将正确同源重组的ES细胞注射到C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合体小鼠。挑选嵌合率在50%的雄鼠与C57BL/6J小鼠交配,获得的灰鼠经PCR鉴定为杂合子小鼠。杂合子小鼠交配后获得纯合子小鼠。结果成功构建了打靶载体pBR322-MK-Trpv6。电穿孔后,共获得24个正确同源重组的克隆,同源重组效率为25%。同源重组的克隆经显微注射后,共获得4只嵌合率大于50%的雄鼠。嵌合鼠与C57BL/6J小鼠交配,获得57只来源于ES细胞的灰鼠,PCR鉴定证实其中17只为杂合子小鼠,阳性率为29.8%。杂合子小鼠交配获得纯合子小鼠。经蛋白质印迹分析证实纯合子小鼠无Trpv6蛋白的表达。结论成功建立了Trpv6基因敲除小鼠模型,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象。

上皮钙通道基因在维生素D受体和Calbindin-D28k双基因敲除鼠中的变化

目的研究上皮钙通道TRPV5和TRPV6基因与维生素D受体(VDR)和钙结合基因Calbindin-D28k的关系,以及肾钙的重吸收减少是否与TRPV5和TRPV6基因表达减少有关。方法制备VDR和CaBP-D28k双基因敲除小鼠,普通和高钙食物喂养下,检测野生型鼠(WT),CaBP-D28(-/-),VDR(-/-),和VDR(-/-)/CaBP-D28k(-/-)鼠的体重、摄食量及血尿参数值,用实时RT-PCR的方法检测各种鼠肾脏TRPV5和TRPV6的mRNA水平。结果普通饮食下,双基因敲除小鼠尿钙的分泌和血清甲状旁腺激素水平更高。TRPV5和TRPV6两者的表达在CaBP-D28k敲除鼠中均无变化,而在VDR敲除鼠和双基因敲除鼠中下调的幅度相当。高钙饮食下,VDR及双基因敲除小鼠的血离子钙水平正常。所有小鼠这两个基因的表达普遍降低,而在VDR和双基因敲除鼠中的表达更低。结论这些结果证实了上皮钙通道基因受钙和维生素D的调节,CaBP-D28k的缺失对两者无影响。肾钙的重吸收减少与TRPV5和TRPV6基因表达无明显关系。