RNAi研究TrxR1在肝癌细胞增殖中的作用及不同中医治法的调节

目的观察不同中医治法对大鼠肝癌TrxR1表达的调控差异,以及TrxR1在人肝癌细胞增殖中的作用。方法将84只雄性Wistar大鼠随机分为正常组和模型组以及实验组,除正常组外均采用DEN诱发大鼠肝癌,实验组分别经中药健脾益气、清热解毒、活血化瘀等治疗,检测各组大鼠肝癌组织(正常组取肝组织)TrxR1表达的差异;设计2个人TrxR1基因siRNA靶点,将重组质粒通过脂质体转染入SMMC-7721人肝癌细胞株,MTT法检测转染前后细胞生长增殖情况、Real-time-PCR检测该基因的表达差异。结果芯片结果显示,TrxR1基因在大鼠肝癌形成后表达显著增加,益气健脾治法明显下调其表达;采用MTT法筛选到一个TrxR1基因RNA干扰有效靶序列,脂质体转染144 h后细胞的生长增殖得到了明显的抑制;实时荧光定量PCR检测表明,转染72h后该基因的表达量明显降低。结论肝癌细胞恶性增殖有赖于TrxR1基因的高表达,益气健脾方药能显著下调该基因表达。

弥漫大B细胞淋巴瘤中Trx、TrxR-1及TXNIP的表达及临床意义

目的探讨硫氧还蛋白(Trx)、硫氧还蛋白还原酶1(TrxR-1)及硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)在弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)中的表达及临床意义。方法采用免疫组化法检测60例DLBCL和20例淋巴结反应性增生组织中Trx、TrxR-1及TXNIP的表达,并分析三者表达与DLBCL临床病理特征的关系。结果DLBCL中Trx和TrxR-1的阳性率分别为68.33%和76.67%,淋巴结反应性增生组织中Trx和TrxR-1的阳性率分别为25.00%、35.00%,DLBCL中Trx和TrxR-1的阳性率均明显高于淋巴结反应性增生组织,差异有统计学意义(P<0.05);TXNIP在DLBCL中的表达(20.00%,12/60)低于淋巴结反应性增生组织(80.00%,16/20),差异有统计学意义(P<0.05)。DLBCL中Trx、TrxR-1和TXNIP的表达与临床分期、IPI评分有关(P<0.05),与患者性别、年龄、乳酸脱氢酶水平无关(P>0.05)。ROC结果显示,Trx、TrxR-1单项检测曲线下面积(AUC)分别为0.717与0.708,而两者联合检测AUC为0.767,高于单独检测。结论Trx、TrxR-1及TXNIP表达异常可能与DLBCL发生、发展有关,联合检测Trx和TrxR-1表达可为DLBCL的诊断提供参考价值。

少弱精子症患者精子候选差异蛋白Trx 2、TrxR 1的验证及在少精、弱精子症中的表达研究

目的:根据TMT技术筛选少弱精子症患者精子差异蛋白的结果,选取硫氧还蛋白2(thioredoxin 2,Trx 2)、硫氧还蛋白还原酶1(thioredoxin reductase 1,TrxR 1)进行验证,探讨二者在少精、弱精和少弱精子症中的表达变化及其意义。方法:收集105例少精子症组(O组)、150例弱精子症组(A组)、50例少弱精子症组(OA组)和106例正常精液男性(N组)精液,分离出精子,对少弱精子症进行串联质谱标签(Tandem Mass Tag,TMT)技术蛋白质组学分析,根据少弱精子症组的精子差异蛋白结果选取Trx 2、TrxR 1,通过免疫荧光和免疫印迹方法检测其在O组、A组、OA组的表达情况。结果:TMT技术蛋白质组学结果显示Trx 2为上调差异蛋白(为N组的1.31倍),TrxR 1为下调差异蛋白(为N组的0.82倍)。免疫荧光和免疫印迹结果显示O组、A组、OA组Trx 2表达显著高于N组(P<0.05),O组、OA组TrxR 1的表达显著低于N组(P<0.05)。二者在OA组的结果与蛋白质组学结果一致。结论:Trx 2、TrxR 1可能在少精、弱精及少弱精子症的发生中起着重要的作用,并有望成为少弱精子症患者精子的候选标志物及治疗靶点。

TrxR抑制剂AA1激活抗肿瘤免疫抑制胃癌进展的实验研究

目的:探究TrxR抑制剂AA1激活抗肿瘤免疫抑制胃癌进展的作用及机制。方法:构建C57BL/6J荷瘤小鼠模型,给予TrxR抑制剂AA1治疗为AA1组,给予PBS为对照组。分别测量不同时间点肿瘤体积,末次给药后观察肿瘤形态与质量;采用ELISA法检测外周血中MDA、SOD含量,流式细胞术检测外周血CD4^(+)、CD8^(+)、NK细胞水平,Western blot检测肿瘤组织中JNK及p-JNK表达。结果:与对照组相比,AA1组小鼠肿瘤体积明显减小(P<0.05),肿瘤质量显著降低,MDA含量明显降低,SOD含量明显升高,外周血CD4^(+)、NK细胞数显著增多,而CD8^(+)细胞数显著减少(P<0.05),2组小鼠肿瘤组织中JNK蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),但AA1组小鼠p-JNK表达显著高于对照组(P<0.05)。结论:TrxR抑制剂AA1可激活荷瘤小鼠免疫功能,增强其机体抗氧化能力,提高JNK信号通路蛋白磷酸化水平,从而抑制其胃癌进展。

毛壳素作为TrxR1抑制剂诱导卵巢癌细胞凋亡的机制研究

目的探究硫氧还蛋白还原酶1(TrxR1)在毛壳素(Chaetocin)诱导卵巢癌细胞凋亡中的作用及相关分子通路。方法体外培养卵巢癌细胞系OVCAR-3,CCK-8法和试剂盒检测Chaetocin对OVCAR-3细胞增殖和细胞中TrxR1活性的影响。利用分子模拟对接和分子动力学分析Chaetocin与TrxR1的作用方式,将过表达TrxR1的慢病毒载体(TrxR1-OE)及空载体(Vec)转染入OVCAR-3细胞中,并将其分为:转染Vec的对照组(Vec组)、过表达TrxR1的TrxR1-OE组、Chaetocin处理转染过表达TrxR1或Vec的OVCAR-3细胞组(Chaetocin+TrxR1-OE组和Chaetocin+Vec组)。DCFH-DA法检测各组OVCAR-3细胞中ROS表达,Annexin V-FITC/PI法检测各组细胞的凋亡率,Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白Cle-PARP、Bax、Cle-caspase-3及JNK/c-JUN信号通路中p-JNK/JNK和p-c-JUN/c-JUN比值。结果Chaetocin可显著抑制OVCAR-3细胞的增殖活力,并可与TrxR1直接结合来抑制OVCAR-3细胞中TrxR1活性。TrxR1-OE组中ROS含量,细胞凋亡率,细胞中Cle-PARP、Bax、Cle-caspase-3表达和p-JNK/JNK、p-c-JUN/c-JUN比值与Vec组相比,差异均无统计学意义(P>0.05),Vec+Chaetocin组、TrxR1-OE+Chaetocin组与Vec组相比均显著升高(P<0.05)。与Vec+Chaetocin组相比,TrxR1-OE+Chaetocin组中ROS含量,细胞凋亡率,细胞中Cle-PARP、Bax、Cle-caspase-3表达和p-JNK/JNK、p-c-JUN/c-JUN比值均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Chaetocin可在体外通过激活JNK/c-JUN通路来抑制TrxR1活性促进卵巢癌细胞中ROS的积聚,从而诱导细胞发生caspase途径的凋亡。

甘草查尔酮A对结肠癌细胞中氧化还原稳态调控的影响

目的研究甘草查尔酮A对结肠癌细胞氧化还原调控的作用机制。方法噻唑蓝(MTT)法检测甘草查尔酮A对结肠癌细胞活性的影响;经甘草查尔酮A或活性氧(ROS)抑制剂处理后,流式细胞术和Western blot法检测结肠癌细胞凋亡率、凋亡蛋白和ROS水平;酶学实验和试剂盒检测甘草查尔酮A对硫氧还蛋白还原酶1(TrxR1)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性的影响;分子对接和Western blot法检测甘草查尔酮A对TrxR1蛋白的作用;沉默结肠癌细胞中TrxR1蛋白,经甘草查尔酮A处理后,检测ROS水平及凋亡率变化;经甘草查尔酮A或还原型谷胱甘肽(GSH)抑制剂处理后,检测细胞GSH水平及凋亡率。结果甘草查尔酮A能抑制结肠癌细胞活性(P<0.05,P<0.01),诱导结肠癌细胞发生凋亡(P<0.05,P<0.01),并上调其ROS水平;ROS抑制剂能逆转甘草查尔酮A引起的ROS水平上升和促凋亡作用(P<0.01);甘草查尔酮A能选择性抑制TrxR1活性(P<0.05,P<0.01),对TrxR1蛋白表达则几乎无影响(P>0.05);沉默TrxR1和GSH抑制剂均能协同甘草查尔酮A的促凋亡作用(P<0.01),甘草查尔酮A对GSH水平几乎无影响(P>0.05)。结论甘草查尔酮A可能通过抑制TrxR1蛋白活性、上调ROS水平的方式诱导结肠癌细胞凋亡。

利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除TrxR1基因的HCT-116细胞株

为更好地研究靶向硫氧还蛋白还原酶1的小分子化合物的细胞内靶点选择性,利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除TrxR1基因(编码硫氧还蛋白还原酶1)的HCT-116细胞株。首先根据TrxR1基因序列和CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计并选择合适的敲除位点,再根据敲除位点序列设计敲除TrxR1基因的sgRNA干扰序列,以pCasCMV-Puro-U6空质粒载体为骨架构建能表达该sgRNA干扰序列的重组质粒。质粒共转染至HCT-116细胞后,利用嘌呤霉素筛选TrxR1敲除的HCT-116细胞,通过DNA测序、免疫蛋白印迹、TRFS-green荧光探针和细胞内TrxR1酶活力检测等方法鉴定和验证HCT-116细胞的TrxR1基因敲除效果。进一步通过CCK-8实验初步研究靶向TrxR1小分子化合物对细胞内TrxR1酶活力和细胞增殖力抑制的相关性。结果显示,表达sgRNA干扰序列的重组质粒可以敲除HCT-116细胞中TrxR1基因,筛选获得的稳定敲除细胞HCT116-TrxR1-KO中无TrxR1蛋白表达,而靶向TrxR1小分子抑制剂对该细胞无TrxR1酶活力和细胞增殖力抑制效果。本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建了HCT-116的TrxR1基因敲除的稳定细胞株,为进一步研究TrxR1在相关疾病的发生机制和治疗中的作用奠定了基础。