TrypLE双抗体夹心定量ELISA检测方法的建立及验证

目的建立TrypLE双抗体夹心定量ELISA检测方法,并进行验证。方法采用正交试验确定捕获抗体、检测抗体最佳浓度,建立TrypLE双抗体夹心定量ELISA检测方法,并对方法进行线性范围、特异性、检测限、定量限、准确性、重复性验证;采用建立的方法检测多种生物制品,验证方法的适用性。结果选定捕获抗体用3μg/mL浓度包板,检测抗体稀释15000倍建立TrypLE双抗体夹心定量ELISA检测方法。该方法线性范围为0.41~40.00 ng/mL,检测限为0.258 ng/mL,定量限为0.5 ng/mL;检测标准品、样品时,测量偏差小于5%;重复性验证CV<5%;不同类型样品加标回收率在80%~120%之间。结论建立的TrypLE双抗体夹心定量ELISA检测方法特异性、准确性、重复性良好,可准确、有效、快捷地检测各种类型生物制品中TrypLE的残留量。

大脑皮层神经元原代培养方法的改良及一种体外缺氧缺糖简易模型的建立

目的改进SD胎鼠大脑皮层神经元体外原代培养方法及其一种缺氧缺糖(OGD)简易模型建立。方法用温和的TrypLE胰酶消化得到单个皮层神经细胞,用含有B27的Neurobasol培养基进行培养。培养7 d后,将其培养液换成无糖DMEM培养液,放入缺氧装置中分别培养4、5及6 h,利用MTT法检测细胞存活率,并用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞培养液中LDH的释放量。结果分离和培养的神经元生长状态良好,免疫荧光方法证明该方法培养的大脑皮层神经元纯度可达到(93.2±1.3)%,能够达到实验研究的要求。细胞OGD 4、5及6 h后,细胞存活率分别为(52.7±1.3)%、(26.5±3.3)%及(20.8±1.1)%;LDH的释放量分别为(52.9±4.8)%、(89.3±1.3)%及(93.2±1.1)%。结论改良后的培养方法能够稳定地获得高纯度的SD胎鼠大脑皮层神经元,用厌氧发生装置替代三气培养箱建立了一种OGD简易模型,同时选择OGD 4 h作为缺氧缺糖模型最佳时间点。

一种改良后的大脑皮质神经元细胞的原代培养模型建立及鉴定

目的在传统的大脑皮质神经元的提取和培养方法基础上进行优化改良以获得高收率、高纯度、高质量、低死亡率、背景干净的皮质神经元细胞。方法分别采用传统的含EDTA的0.25%Trypsin分离培养的皮质神经元,与改良后用混有Tryple Express和DnaseI的消化液,经弹拨分散、手法震荡,提前一次离心后种植培养的皮质神经元。接种后的第1、3、5、6、7 d,显微镜观察细胞形态,第7 d用免疫荧光法对神经元细胞进行鉴定以及检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的释放量。结果与传统的胰酶提取方法相比,改良后获得的皮质神经元生长状态更优,突触发育良好,双极神经元形态典型,杂质细胞及碎片含量少,背景干净,且具有高纯度和高存活率的特性。结论本研究在组织细胞分离消化,弹拨分散、手法震荡,提前一次离心,多重细节方面进行了探索与改良后成功建立了一种结果稳定,简单可行的皮质神经元原代培养方法,是研究神经科学领域较为理想的模型。

一种改进的小脑颗粒神经元原代培养方法及其性质鉴定

目的在已报导的原代小脑颗粒细胞(cerebellar granule neurons,CGNs)的提取培养方法基础上进行改进,以获得较少杂质、更高存活率及更高纯度的CGNs,为后续体外研究做准备。方法将Tryple Express消化液消化及前后两次离心后得到的单细胞悬液,经台盼蓝活细胞计数后接种在预先用多聚赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)包被的培养板中。接种20~24 h后,加入10μmol·L-1的阿糖胞苷(cytosine arabinoside,Ara-C),以及从d 4开始每隔3天加入终浓度5 mmol·L-1的Glucose。借助荧光显微镜及神经元特异性标志物微管蛋白(β-Ⅲ-tubulin)对CGNs细胞进行形态观察及纯度鉴定。结果与原有的胰酶提取方法相比,改进后的CGNs提取方法细胞生长状态良好、突触发育完善、细胞碎片等杂质含量较少,并具有较高存活率及纯度(97%)。结论该方法简便可行,结果稳定,可以为体外神经元的生长发育、轴突再生和神经系统疾病的研究提供有力支持。

马羊膜上皮干细胞的分离培养和鉴定

通过Tryp LE消化马羊膜收集羊膜上皮细胞,经过传代培养后,用免疫荧光染色、RT-PCR及流式细胞技术(FACS)分析其干细胞特征。免疫荧光染色发现马羊膜上皮细胞表达SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81,只有少量的半贴壁细胞表达Oct4;RTPCR进一步证实马羊膜上皮细胞表达Oct4、Nanog和Sox2,而不表达STAT-3;流式细胞技术分析显示马羊膜上皮细胞也表达CD44、CD90、CD105,但不表达CD45。马羊膜上皮细胞培养三代时,平均倍增时间为(1.25±0.17)d。研究结果表明,通过Tryp LE消化马羊膜上皮可以分离获得马羊膜上皮细胞。

不同类型消化液消化Vero细胞的比较

目的 比较胰蛋白酶(胰酶)和TrypLE消化Vero细胞的效果,确定细胞工厂培养Vero细胞的最佳消化工艺。方法 10层细胞工厂中Vero细胞生长成致密单层后,分别用(37±1)℃预热的0. 25%胰酶和TrypLE及室温(18~26℃)的TrypLE进行消化,吸取消化后的细胞悬液进行细胞计数,并检测细胞活率。将消化后的细胞悬液接种至生物反应器中继续培养,检测葡萄糖代谢情况,并进行室温TrypLE消化细胞的重复性验证。结果 用(37±1)℃0. 25%胰酶、TrypLE和室温TrypLE消化细胞所获得的平均细胞密度分别为1. 70×10^6、1. 68×10^6、1. 65×10^6个/m L,细胞活率均在95%以上。与0. 25%胰酶相比,使用TrypLE消化的细胞再培养时葡萄糖消耗量较高。10层工厂细胞消化所获细胞数的变异系数(CV)为2. 47%,消化传代后Vero细胞培养阶段葡萄糖代谢量的CV均小于10%。结论TrypLE作用温和,消化时细胞损伤较小,重复性好,细胞工厂规模化培养Vero细胞过程中可利用TrypLE替代胰酶进行细胞传代。