重组荞麦胰蛋白酶抑制剂延长C.elegans寿命的作用机制

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat trypsin inhibitor,r BTI）是一种来源于荞麦PotatoⅠ抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有很好的生物活性及功能。先前的研究表明,r BTI在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中具有很好的延长寿命的性质,但其具体的作用机制还不太清楚。本文的研究证明,r BTI能够调节转录因子DAF-16的转录活性,进而影响线虫的寿命,且该性质与其胰蛋白酶抑制活性密切相关。通过定点突变技术,分别对r BTI的45位、53位和44位氨基酸活性位点进行突变,获得了4种不同胰蛋白酶抑制活性的r BTI突变体,分别命名为r BTI-R45A,r BTI-R45F,r BTI-W53R和r BTI-P44T。经典模式生物秀丽隐杆线虫寿命检测实验显示,野生型r BTI可以明显延长C.elegans的寿命,且在0-10μmol/L范围内具有浓度依赖性。和未处理对照组相比,10μmol/L野生型r BTI延长寿命幅度可达到14.5%,但是突变体r BTI-R45 A,r BTI-R45 F和r BTI-W53 R均不同程度失去了延长寿命的功能。利用荧光显微观察及qRT-PCR等方法进一步研究发现,野生型r BTI可增强寿命调控转录因子DAF-16的转录活性。与寿命检测实验结果一致,4种r BTI突变体均不能使DAF-16转录活性增强。上述结果表明,在C.elegans中,r BTI可增强长寿因子DAF-16的转录活性,进而延长虫体寿命,且该功能的发挥依赖于其适当的胰蛋白酶抑制活性。本文的结果为进一步研究开发r BTI的功能提供了实验支持和理论基础。

刺桐胰蛋白酶抑制剂突变体在大肠杆菌中表达及在tPA纯化中的应用

目的构建刺桐胰蛋白酶抑制剂突变体(rserETI)原核表达载体,制备表达产物,用于tPA的纯化。方法设计合成rserETI编码序列DNA片段,以PCR法扩增出全长编码区序列,经酶切后克隆至pET9a表达载体,转化大肠杆菌JM109DE3,以IPTG诱导表达。表达产物经变性、复性、QFF层析纯化后,测定其活性,并与溴化氰活化的Sepharose偶联合成亲和层析柱,纯化rtPA。结果rserETI的表达量约占大肠杆菌菌体总蛋白的30%,复性率为80%,经QFF层析纯化后,蛋白浓度为1.58mg/ml,SDS-PAGE检测显示无杂蛋白污染,纯度大于95%,对rtPA突变体的抑制比活性为4×104IU/mg。偶联合成的rserETI-Sepharose亲和层析柱能特异性地纯化rtPA,rtPA突变体纯度达96%,比活性为5.07×105IU/mg。结论已成功构建了rserETI原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达,制备的表达产物可用于rtPA的纯化。

蛋白质工程的研究

对近期蛋白质工程的工作进行了综合报道，涉及到胰蛋白酶、金属硫蛋白、胰岛素、尿激酶原、组织型纤溶酶原激活剂、ＲＧＤ肽等蛋白质或多肽的结构与功能研究以及分子改造。

截短型rBTI的表达、纯化及其对EC9706细胞生长的抑制作用

依据先前获得的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)氨基酸序列及三维分子构像,分别构建了rBTI C末端缺失VVM、TPVVM或VDTPVVM的截短型pExsecI-BTI-t1,pExsecI-BTI-t2和pExsecI-BTI-t3重组质粒.转入大肠杆菌BL21中进行表达,并通过Resource Q阴离子交换层析分离.实验结果显示,3个工程菌均以可溶方式表达,目的蛋白在SDS-PAGE图谱中显示单一条带,其纯度达98%以上.理化性质分析表明,截短型rBTI与野生型rBTI具有相似的胰蛋白酶抑制活性,并具有很好的热稳定性及酸碱稳定性.将野生型和截短型rBTI分别作用于人食管癌EC9706细胞.MTT检测发现,C末端截短不同数目的氨基酸后,与野生型rBTI相比,在相同浓度下截短型rBTI仍具有一定的抑制肿瘤细胞生长作用,其抑制作用范围是截短前的50%左右.这些结果提示,rBTI的C末端氨基酸残基缺失未引起活性区域或功能部位的较大改变,从而保留了其对胰蛋白酶的抑制作用和部分生物学功能.

表面电荷突变与胰蛋白酶底物专一性的改造

分别利用酶切重组和“３＋１”引物ＰＣＲ定点突变的方法构建了三个胰蛋白酶表面电荷双突变体：Ｒ６２Ｄ＋Ｋ９７Ｅ、Ｒ６２Ｄ＋Ｋ１７５Ｅ和Ｋ９７Ｅ＋Ｋ１７５Ｅ．对三者在Ｅ．ｃｏｌｉＸ－９０菌中的表达产物进行了动力学测定，分别得到了三种双突变体在两种ｐＨ条件下，水解ＴＡＭＥ、ＴＬＭＥ两种底物的动力学数据．结果表明，Ｒ６２Ｄ＋Ｋ１７５Ｅ和Ｋ９７Ｅ＋Ｋ１７５Ｅ在ｐＨ６．８５时，对两种底物的催化活性与野生型相比下降了２～３个数量级，当ｐＨ升高至８．８５时，它们的活性基本丧失；双突变体Ｒ６２Ｄ＋Ｋ９７Ｅ虽然催化活性也有所降低，但随着ｐＨ的升高，它对Ｌｙｓ底物的特异性（选择性系数２５倍于Ａｒｇ底物）转变为对Ａｒｇ底物略高的特异性，基本符合分子设计．实验结果还表明，各种双突变体催化活性的降低主要是由于酶和底物的亲和力降低引起的．

二硫键Cys139-Cys206影响人胰蛋白酶的稳定性

胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,可特异切割精氨酸及赖氨酸C端肽键。重组人源阳离子胰蛋白酶(recombinant human cationic trypsin:rht1)的稳定性明显高于重组人源阴离子胰蛋白酶(recombinant human anionic trypsin:rht2)。比较ht1和ht2的氨基酸序列和三维结构,二者的氨基酸序列同源性为95%,rht1比rht2多1对二硫键Cys139-Cys206。为解释该二硫键对其稳定性的作用,构建rht1的Cys139-Cys206二硫键缺失突变体rht1-dC139S-C206S和rht2的增加该对二硫键的突变体rht2-S139C-S206C。进行了重组表达和纯化,并测定rht1、rht2及两个突变体的酶学性质,对比其稳定性。结果发现,与野生型rht1、rht2相比,突变体的酶学动力学参数km和kcat值与最适pH均未有较大差异。但在pH3~12条件下的稳定性,rht1-dC139S-C206S比rht1低46.6%;rht2-S139C-S206C比rht2高30.3%。对比其热稳定性,40℃保温4 h,rht1残余活性为92.4%,而rht1-dC139S-C206S降为60%。60℃保温4 h,rht2-S139C-S206C残余活性为83.3%,而rht2完全失活。表明了该二硫键Cys139-Cys206对人胰蛋白酶稳定性的重要性。进一步进行结构模拟和分析,解释了该对二硫键对稳定性影响的机制。

重组猪胰蛋白酶突变体基因在大肠杆菌中的克隆、表达与活性分析

胰蛋白酶是肽链内切酶,专一性水解多肽链中赖氨酸和精氨酸羧基端形成的肽键。胰蛋白酶切割胰岛素原生成胰岛素,在胰岛素的生产中发挥着重要作用,但由于胰蛋白酶对赖氨酸和精氨酸的切割选择性差别不大,会在切割反应中产生副产物。所以研究开发对底物切割选择性增强的胰蛋白酶,减少胰岛素生产过程中副产物的产生具有较高的应用价值。以猪源胰蛋白酶原基因为模板,通过重叠延伸产生特异位点突变的方法扩增突变胰蛋白酶原(Tg M)基因,该基因编码猪胰蛋白酶的Ser172Ala突变体。将Tg M基因插入到表达载体p ET28a中,转化E.coli DH5α,利用卡那霉素抗性筛选出构建成功的重组质粒p ET28a-Tg M并将其转化E.coli BL21(DE3),构建含Tg M基因的工程菌株并诱导表达。14%SDS-PAGE显示,重组菌经乳糖诱导后表达了目的蛋白,并以包涵体形式存在。包涵体经尿素裂解液变性后,通过稀释法复性,复性液超滤处理并用胰蛋白酶切割,经DEAE-FF离子交换层析分离纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE分析,结果表明与胰蛋白酶条带位置相同;用紫外分光光度法检测酶活力,测得突变胰蛋白酶的酶活力为1 300 U/m L,比活力为1 566.27 U/mg。将最终纯化获得的突变胰蛋白酶用于胰岛素原的切割,HPLC检测分析结果表明,突变胰蛋白酶对底物中Arg的切割选择性大于Lys,因此在对胰岛素原的切割反应中,副产物的量明显减少。

虎纹捕鸟蛛Kunitz型毒素基因的分子改造和表达

目的构建HW11c40突变体,寻找合适的表达系统表达HW11c40突变体和HWTX-XI(虎纹捕鸟蛛毒素-XI),解决HWTX-XI来源问题和HW11c40改造后毒素难于获取的难题,为合适HW11c40突变体的筛选和治疗急性胰腺炎高效新药的研制奠定基础。方法用PCR定点突变的方法突变HW11c40相关氨基酸残基,构建HW11c40突变体。HW11c40突变体和HWTX-XI基因经PCR扩增后插入到pET-40b(+)载体,基因5'端插入肠激酶切割位点,再重组到大肠埃希菌BL21(DE3)进行原核周质表达,获得相应的融合蛋白并进行SDS-PAGE鉴定,用镍柱纯化融合蛋白。融合蛋白用肠激酶酶切,释放出的目的蛋白用Tricine-SDS-PAGE进行鉴定,用镍柱分离目的蛋白,进行高效液相色谱进行进一步分离纯化后作质谱鉴定。对HW11c40突变体和HWTX-XI的表达时间、温度和IPTG浓度进行优化。结果成功获得HW11c40的4个突变体,并正确构建HW11c40突变体和HWTX-XI的原核表达载体。经SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE鉴定,重组质粒转化菌在无IPTG诱导的情况下成功表达所有HW11c40突变体和HWTX-XI的融合蛋白,经肠激酶酶切均获得对应的目的蛋白,其中HWTX-XI表达量为3.4mg/L。结论成功构建出HW11c40突变体和HWTX-XI的重组质粒并在原核细胞内高效表达出相应的目的蛋白,开辟了基因工程表达HWTX-XI的新途径,同时解决了HW11c40改造后毒素获取难题,突破了整个系列研究的瓶颈,为突变体的筛选及治疗急性胰腺炎高效新药的研制奠定了基础。

虎纹捕鸟蛛毒素XI(HWTX-XI)突变体的真核表达及活性鉴定

虎纹捕鸟蛛毒素-XI(HWTX-XI)是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离的含55个氨基酸残基的蛋白质,兼有胰蛋白酶抑制活性和电压门控钾离子通道抑制活性。通过突变HWTX-XI上的钾离子通道抑制活性关键氨基酸残基设计了2个突变体(分别突变以下氨基酸残基:R5I,R10T,R25A和R5I,R25A),利用pVT102U/α表达载体在酿酒酵母S78中成功表达并获得了高纯度的重组蛋白质;通过分光光度计比色法、膜片钳技术和小鼠脑室注射分别比较三者的胰蛋白酶和钾通道抑制活性以及动物毒性,结果显示:HWTX-XI突变体与HWTX-XI有相同胰蛋白酶抑制活性,但其钾通道活性降低约30倍;小鼠脑室注射HWTX-XI的半致死剂量为247.3μg/kg体重,而突变体在剂量达到25 mg/kg时仍未见明显毒性反应。获得了胰蛋白酶抑制活性保留,但钾通道抑制活性和动物毒性大大降低的突变体,为HWTX-XI胰蛋白酶抑制活性的应用奠定了基础。