丹参Remorin基因SmREM1.2的克隆及生物信息学和表达分析

Remorin蛋白是一类植物特异的寡聚丝状蛋白,定位于细胞膜,介导脂筏微区形成,在植物逆境胁迫应答及植物免疫调节等过程中发挥重要作用。丹参是我国大宗类中药材,广泛用于心脑血管疾病等的治疗。但目前丹参Remorin蛋白的相关研究报道还不多。本研究基于丹参转录组及基因组数据库,克隆得到丹参Remorin基因SmREM1.2,通过生物信息学方法对其氨基酸组成、保守序列、系统进化进行分析,并对其亚细胞定位及在盐胁迫下的表达情况进行分析。结果表明,该基因CDS全长585 bp,编码194个氨基酸残基。SmREM1.2蛋白为弱酸性不稳定的亲水性蛋白,无信号肽,无跨膜区,含有Remorin_N和Remorin_C保守结构域,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;氨基酸序列分析结果显示其C端具有高度保守的coiled-coil模体,属于典型的REM蛋白;系统进化树分析结果表明SmREM1.2与芡欧鼠尾草(Salvia hispanica)的Remorin蛋白亲缘关系较近。构建pCAMBIA-SmREM1.2-GFP重组载体,利用烟草瞬时转化系统对SmREM1.2进行亚细胞定位分析,发现该蛋白定位于细胞膜上。通过实时荧光定量PCR分析发现SmREM1.2受盐胁迫诱导上调表达,推测其在盐胁迫下发挥重要作用。本研究结果可为后期深入探索SmREM1.2基因的功能及应用提供理论依据。

超表达小麦基因TaSOD1.1和TaSOD1.2对烟草耐低温能力的影响

【目的】研究超表达小麦基因TaSOD1.1和TaSOD1.2对烟草耐低温能力的影响。【方法】采用农杆菌介导的遗传转化技术,获得融合靶基因的转基因烟草植株;通过比较低温处理后对照和转基因系的表型和生理指标,鉴定超表达靶基因对烟草耐低温能力的调控效应。【结果】以分子检测鉴定的插入单拷贝基因的4个转基因系和对照为材料,低温处理后超表达外源基因的转基因植株叶片失绿缓慢,叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性明显增加,反映细胞膜质过氧化程度的丙二醛(MDA)含量明显下降;叶片叶绿素a、b和类胡萝卜素含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量均明显提高。【结论】超表达小麦TaSOD1.1和TaSOD1.2的烟草植株,具有增强SOD活性、明显缓解低温造成的细胞膜质过氧化程度、改善低温胁迫下植株的生理功能,可进而改善植株抵御低温胁迫的能力。

1.2倍基因组长度C基因型乙型肝炎病毒重组体构建及其在HepG2细胞中表达和复制

目的构建基于pBlueBac4．5质粒的1．2倍基因组长度C基因型乙型肝炎病毒（HBV）重组体，并研究其在HepG2细胞中的表达和复制。方法以重组质粒pWT上的1．2倍基因组长度C基因型HBVDNA序列和pBB4．5HBV1．3（D基因型）上的pBlueBac4．5载体序列为模板，构建重组质粒pBB4．5HBV1．2（C基因型）。用FuGENEHD瞬时转染法，将pBB4．5HBV1．2导人HepG2细胞。用化学发光免疫分析法、Southern印迹杂交法、荧光定量PCR法，分别检测转染后不同时间点HBsAg和HBeAg、HBV复制中间体及HBVDNA水平。此外，对转染时重组质粒用量进行优化。结果酶切和序列分析证实，pBB4．5HBV1．2重组质粒构建成功。初步转染实验证实，在转染细胞培养上清中可检测到HBsAg和HBeAg。优化后转染条件为：使用60mm细胞培养皿，8～11tLgpBB4．5HBV1．2，质粒与转染试剂5：9（μg：μl）。在此条件下，5d实验周期内可检测到HBsAg和HBeAg持续表达（峰值一般出现在转染后第3天）、HBVDNA持续复制（10^6～10^8拷贝／ml）及HBVDNA复制中间体形成。结论在HepG2细胞中，建立了以杆状病毒转移载体pBlueBac4．5为基础的1．2倍基因组长度C基因型HBV体外培养体系，有望为研究HBV耐药、筛选新抗病毒药物等提供新技术平台。

抗菌肽Aurein1.2基因的同向串联及其克隆载体的构建和鉴定

目的: 构建抗菌肽Aurein1 2基因多拷贝串联体,并将目的基因串联产物克隆到载体pUC18上.方法: 分别合成含相同黏性末端的Aurein1 2单拷贝基因、EcoRⅠ前接头及SalⅠ后接头.单拷贝基因分别与前、后接头连接,通过控制基因和接头加入的量及时间,可得到两侧有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的同向串联的多拷贝基因,选取合适拷贝数的基因,将其克隆到载体pUC18上.结果: PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证明多拷贝基因重组质粒构建成功.结论: 该方法能方便高效地获得所需的多拷贝基因,为进一步克隆到表达载体并进行高效表达打下基础.

辣椒COI1.2基因的克隆、表达分析和植物表达载体的构建

利用RT-PCR技术,通过同源克隆从辣椒中分离到CaCOI1.2基因,采用生物学软件对序列进行生物信息学分析,采用实时定量RT-PCR技术分析基因的表达模式.结果表明：克隆到的CaCOI1.2基因长度为2041 bp,推测其读码框大小为1812 bp,编码603个氨基酸.在CaCOI1.2蛋白质N-端有一个F-box结构域,C-端有6个富含亮氨酸结构域.CaCOI1.2蛋白的氨基酸与巳知其他植物COI1蛋白序列有53.03 ％～93.37％的一致性.聚类分析结果显示：CaCOI1.2与番茄、烟草和葡萄等双子叶植物的亲缘关系较近,而和水稻、玉米、高粱等单子叶植物的亲缘关系较远.CaCOI1.2在辣椒的不同生长发育时期的组织中都能表达,在花和青熟期果实中表达水平较高,表明CaCOI1.2在花和果实的发育过程中起重要作用.构建植物表达载体pBI121-CaCOI1.2,并导入根癌农杆菌LBA4404中,得到植物转化工程菌,这为下一步用于辣椒等作物的转基因操作、研究CaCOI1.2基因在植物中的功能奠定了基础.

木薯SDH蛋白的序列分析及其与MeH1.2关系的研究

【目的】山梨糖醇脱氢酶(SDH)在调控蔷薇科植物果糖和山梨醇转化中起重要作用,也参与植物对逆境的应答过程,木薯SDH功能的研究可以为培育优质木薯种质提供理论基础。【方法】以‘SC124’的cDNA为模板克隆木薯SDH基因,并利用实时荧光定量PCR分析木薯SDH基因的组织特异性及其对干旱、低温、PEG和ABA的响应模式。通过筛选木薯干旱和低温混合的酵母cDNA文库,并利用Y2H点对点及其双分子荧光互补(BiFC)实验确认与目标蛋白的关系。【结果】木薯SDH基因CDS全长1092 bp,编码364个氨基酸,与数据库中的序列无差异。MeSDH蛋白含有催化锌结合位点,NADP结合位点,结构锌结合位点,属于MDR超家族。烟草叶片表皮细胞瞬时表达显示MeSDH蛋白定位于细胞核。MeSDH基因的表达量在功能叶、幼嫩叶、须根和茎中依次降低。MeSDH基因受干旱、低温和PEG胁迫诱导在木薯叶片上调表达,在ABA处理后的木薯叶片和根系中都显著上调表达。文库筛选、Y2H点对点和BiFC实验证实MeH1.2与MeSDH互作。【结论】MeSDH基因可以响应多种胁迫上调表达,并可能在蛋白水平和MeH1.2共同作用。

拟南芥防御素基因PDF1.2启动子与GUS重组载体的构建与转化

PDF1.2基因在植物的防御系统中扮演着重要的角色,其编码产生的植物防御素参与了植物对真菌入侵、病毒感染、不良环境等逆境胁迫的防御反应。试验利用从拟南芥中通过PCR扩增和克隆的该基因启动子构建GUS报告基因的表达载体,通过根癌农杆菌浸渍转化法将表达报告基因转入拟南芥中,筛选获得了转化植株。获得以下主要结果:(1)成功克隆了拟南芥PDF1.2基因的启动子并将其与带GUS标记基因的载体进行了融合,得到了重组的融合载体;(2)成功的将带GUS标记基因的拟南芥PDF1.2基因启动子融合载体转入到拟南芥植株中并利用其自带抗性标记筛选到了抗性植株;(3)利用GUS染色技术检测了转基因植株中PDF1.2基因启动子的表达情况。

Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾细胞癌5例临床病理及基因融合分析

目的回顾性分析Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾细胞癌的临床病理特点、鉴别诊断、治疗和预后。方法对5例Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾细胞癌的临床资料、组织学特点、免疫组化及基因荧光原位杂交进行分析,并结合相关文献讨论。结果 5例患者中男性4例,女性1例,年龄19~37岁。主要症状是血尿、腰痛及腹部包块。B超及PET-CT均提示肾实质占位,其中2例肿瘤发生转移。肿瘤最大径3~8 cm;切面实性、灰黄色,似有包膜。镜下见特征性透明细胞构成的乳头状结构,不同比例的腺泡状及巢状排列,有大量肿瘤细胞胞质透明至嗜酸性,染色质呈囊泡状,核仁易见,多数可见砂砾体。5例肿瘤TFE3、PAX8和CD10均(+),存在异常TFE3分离信号。2例术后无复发转移,1例失访,2例术后2年内死亡。结论 Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾细胞癌好发于青年人,男性发病率高于女性,发生转移的患者预后较差且术后容易复发。其诊断主要依靠临床病史、病理学特征、免疫组化及分子生物学检测。

过表达GmAP1.2转基因大豆的遗传转化及植株发育特性

为研究大豆GmAP1.2(Glyma.08G269800)的生物学功能,通过农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法将GmAP1.2基因遗传转化至大豆天隆1号,获得过表达GmAP1.2转基因植株;并对转基因大豆的株高、花器官、叶片等特性进行分析。结果表明,GmAP1.2过表达使转基因大豆比野生型(WT)早花31d,株高明显降低,且与野生型相比,GmAP1.2转基因大豆叶片变小,叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量分别增加了1.43、1.52和1.57倍,但未影响花器官结构。表明GmAP1.2不仅能够影响大豆的株型,还能影响叶片的大小和叶绿素的含量。本研究结果为进一步阐明大豆AP1基因在大豆中的功能与应用奠定了理论基础。

绵羊角蛋白中间丝基因KIF1.2的克隆及序列分析

为了分析南疆地方品种羊和田羊毛囊角蛋白中间丝KIF1.2基因,以和田羊为实验动物,从绵阳毛囊中提取总RNA,利用反转录获得的cDNA第一链为模板,通过PCR扩增KIF1.2基因,插入pMD18-T克隆载体中经限制性内切酶双酶切和PCR检测双重鉴定并测定序列。结果,扩增出序列长度为1215 bp的基因片段,测序结果与GenBank上已公布的序列同源性为99%。该实验研究将为进一步通过基因和蛋白的调节来改良南疆地方品种羊和田羊羊毛品质提供必要的理论依据。

SlSnRK1.2调控番茄抗灰霉病功能分析

【背景】由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染番茄(Solanum lycopersicum)引起的灰霉病严重威胁番茄生产。植物蔗糖非发酵-1-相关蛋白激酶-1(sucrose non-fermenting-1-related protein kinase 1,SnRK1)参与多种植物对生物胁迫和非生物胁迫响应的调控,然而,番茄SnRK1是否参与对灰霉病抗性未见报道。【目的】以灰葡萄孢侵染番茄过程中上调表达的SlSnRK1.2为研究对象,克隆并分析其调控灰霉病抗性功能,为番茄灰霉病防治提供理论依据和基因资源。【方法】采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)技术,分析SlSnRK1.2在灰葡萄孢侵染番茄过程中以及在番茄不同组织中的表达模式;利用农杆菌介导的瞬时表达技术分析SlSnRK1.2的亚细胞定位情况;借助烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)构建SlSnRK1.2沉默植株,初步分析SlSnRK1.2在番茄与灰葡萄孢互作过程中的作用;利用农杆菌介导的番茄遗传转化体系创制SlSnRK1.2过表达植株,进一步明确SlSnRK1.2在调控番茄对灰霉病抗性中的作用;利用TRV-VIGS技术构建SlSnRK1.2同源基因NbSnRK1.2的沉默植株,分析NbSnRK1.2在烟草与灰葡萄孢互作中的作用。【结果】以Micro-Tom为材料,利用qRT-PCR技术明确SlSnRK1.2的转录表达显著受到灰葡萄孢侵染诱导;亚细胞定位结果显示SlSnRK1.2定位于细胞质和细胞核;qRT-PCR分析表明,SlSnRK1.2在番茄的根、茎、幼嫩叶片、成熟叶片、花蕾和花中均有表达,在茎部的表达量最高;瞬时沉默SlSnRK1.2减弱番茄对灰霉病的抗性,过表达SlSnRK1.2增强番茄对灰霉病的抗性;在此基础上,瞬时沉默SlSnRK1.2的同源基因NbSnRK1.2减弱烟草对灰霉病的抗性。【结论】SlSnRK1.2正调控番茄对灰霉病的抗性,可作为番茄抗灰霉病分子育种的基因资源。

Magainin-Aurein杂合肽基因的合成与克隆

目的:构建抗菌肽Magainin-Aurein杂合肽基因,并将M-A杂合肽基因克隆到载体pUC18上。方法:根据已报道的抗菌肽Magainin-2和Aurein1.2基因的氨基酸序列,推导出其cDNA序列,采用基因片段合成结合PCR扩增的策略,分别获得大量完整的Magainin-2和Aurein1.2基因片段。将两者连接为杂合基因并克隆到载体pUC18上。结果:构建了M-A杂合肽基因重组质粒,经PCR扩增、酶切和DNA测序分析表明,杂合肽基因的DNA序列及阅读框完全正确。结论:pUC18-M-A重组质粒构建成功,为进一步亚克隆到表达载体并进行高效表达打下基础,并为其他抗菌肽杂合肽的制备提供了参考。

犊牛腹泻粪便样本中纽布病毒VP1和RNA依赖性RNA聚合酶基因的序列分析

纽布病毒(Nebovirus,NeV)是国内犊牛腹泻的新发病原,其VP1蛋白含有受体结合位点和中和抗原表位,与病毒的感染和免疫密切相关,本研究旨在分析VP1基因1.2型毒株的分子特征。采用RT-PCR方法,对2019年宁夏和河南的犊牛腹泻粪便样本进行NeV检测,扩增阳性样本完整的主要衣壳蛋白(VP1)和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)。结果显示,宁夏和河南地区NeV检出率分别为11.32%和8.62%。从4个样本中成功获得了1.2型毒株完整VP1和RdRp序列。4个完整VP1与GenBank中73个完整VP1的氨基酸相似性为75.4%~97.8%;与GenBank中仅有的3个1.2型VP1相比,4个毒株在P2区有1个共同的氨基酸突变,在P1区有2个共同的氨基酸突变。与国内基因1.1型、1.3型和1.4型毒株相比,在P2区分别有9、18和14个共同的氨基酸突变,在P1区分别有2个共同的氨基酸突变,在S区分别有1个共同的氨基酸突变。4个完整RdRp均为NB-like基因型,与GenBank中8个完整RdRp的核苷酸相似性为67.2%~94.8%。本文首次在我国检测到VP1基因1.2型毒株,成功获得了4条基因1.2型毒株的完整VP1和RdRp序列,为国内NeV的分子流行病学和遗传进化研究等提供了参考。

橡胶素基因家族4个成员在橡胶树染色体上的定位

笔者以巴西橡胶树‘热研7-33-97’品种为材料,利用原位PCR技术对巴西橡胶树的4个橡胶素基因(Hev1.1,Hev1.2,Hev2.1,Hev2.2)在染色体的位置进行了物理定位分析,并利用荧光原位杂交技术对原位PCR结果进行了验证。结果表明:Hev1.1,Hev1.2,Hev2.1,Hev2.2基因分别位于巴西橡胶树第8号染色体长臂、第7号染色体长臂、第6号染色体短臂和第12号染色体长臂上;信号距着丝粒平均百分距分别为10.88,31.51,63.81和67.92。

电压门控钙离子通道CaV1.2促进小鼠胼胝体而非运动皮质中成年少突胶质祖细胞的存活

在整个生命过程中,少突胶质祖细胞(OPC)增殖并分化为有髓的少突胶质细胞。OPC表达的细胞表面受体和通道,包括电压门控钙通道(VGCC),使它们能够感知并响应神经元活动。CaV1.2是发育过程中OPC表达的主要L型VGCC,它能调控发育过程中OPC的分化。然而,尚不清楚CaV1.2是否对健康成年中枢神经系统(CNS)中的OPC行为有着相似的影响。为了研究CaV1.2在成年期中的作用,我们通过对60 d的Cacna1cfl/fl小鼠(对照组)和Pdgfrα-CreER::Cacna1cfl/fl小鼠(CaV1.2敲除组)给予他莫昔芬,从而实现条件性敲除OPC中的CaV1.2通道。全细胞膜片钳分析显示,CaV1.2敲除使成年OPC中钙离子通过L型电压门控钙通道内流降低了约60%,这证实了它仍然是成年OPC表达的主要L型VGCC。成年OPC中条件性地敲除CaV1.2,可显着提高OPC增殖能力,但不影响新产生的少突胶质细胞的数量,也不影响其形成的节间体的长度或数量。出乎意料的是,CaV1.2敲除导致胼胝体中OPC的大量损失,以至于在他莫昔芬给药后7 d,CaV1.2敲除小鼠的OPC密度仅为对照小鼠的约42%。OPC密度在CaV1.2敲除后的2周内恢复,因为丢失的OPC被CaV1.2敲除后残存的OPC所代替。OPC密度在运动皮质及脊髓中不受影响。因此我们得出结论,钙离子通过CaV1.2进入细胞内对于胼胝体OPC的亚群而言是关键的生存信号,但这并非对于成熟CNS中所有OPC都是至关重要的。

PDF1.2基因在转草酸氧化酶基因甘蓝型油菜中的表达

采用RT-PCR方法检测茉莉酸(JA)/乙烯(ET)依赖性信号途径中关键基因PDF1.2在转草酸氧化酶基因(OXO)油菜株系与未转化对照中的表达差异。结果表明,在转基因油菜不同株系中PDF1.2都有不同程度的上调表达,预示着转OXO油菜对菌核病的抗性增强可能与激活JA/ET依赖性信号途径有关。

拟南芥芥子油苷含量对外源茉莉酸的响应

芥子油苷是一类含氮、含硫的次生代谢产物,可以介导植物与环境之间的相互作用,其合成受茉莉酸类物质的调控。对拟南芥莲座叶进行外源茉莉酸甲酯喷施处理,利用实时荧光定量PCR技术分析了处理后莲座叶中响应茉莉酸基因PDF1.2的表达,并利用高效液相色谱法检测了芥子油苷各组分的含量。结果表明,茉莉酸甲酯处理后,PDF1.2基因的表达量显著上调,在24 h达到最高值,表明外源茉莉酸甲酯能够显著诱导茉莉酸依赖的信号反应;吲哚族和脂肪族芥子油苷各组分含量均发生变化,绝大多数在处理24 h显著上调。表明外源茉莉酸可诱导拟南芥莲座叶中吲哚族和脂肪族芥子油苷的积累,且在处理24 h诱导作用最为明显。

罗勒烯信号传导途径各组分突变体高通量活体荧光筛选技术系统的建立

为了高效率地发现罗勒烯信号传导途径上的各信号传递成分,本研究拟采用正向遗传学的策略,即利用EMS诱变与荧光素酶-荧光素活体荧光成像检测技术体系相结合的方法筛选突变体。为此,构建了指示基因启动子PR1pro::Luciferase和PDF1.2pro::Luciferase质粒并转化拟南芥;通过抗性筛选与PCR检测,鉴定获得了T3代转基因纯合子植株。同时,购买了合适的高灵敏CCD相机、暗箱与软件,通过组装调试,成功制造了一台自制的、经济适用的活体荧光检测仪。转基因纯合植株经过茉莉酸、水杨酸或罗勒烯处理和喷施荧光底物后,放到荧光检测仪中,成功观察到了诱导后的转基因植株释放出高亮荧光,说明活体荧光成像检测系统构建成功。这些结果为进一步利用正向遗传学的方法高效筛选罗勒烯信号传导途径中各成分的突变体植株,以及阐明罗勒烯诱导的防御反应的作用机理奠定了良好基础。

杜仲EuAFP1.2基因遗传转化烟草提高真菌病害抗性

本研究克隆了杜仲(Eucommia ulmoides)抗真菌蛋白EuAFP1.2基因,其CDS序列长为924 bp,编码307个氨基酸。构建植物过表达载体pCAMBIA1301-35S-EuAFP1.2,并遗传转化烟草(Nicotiana tabacum),筛选获得30株转EuAFP1.2基因植株,对转基因烟草植株与野生型及空载体转化烟草植株抗真菌病害能力进行比较。结果表明,在接种小孢根霉菌(Rhizopus microsporus)6 d后转EuAFP1.2烟草植株的相对病斑面积显著小于野生型与空载体转化植株的。接种前后转基因烟草的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(peroxidase,POD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性均先升高后降低,在接种后24 h酶活性显著高于野生型和转化空载体植株的;而丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量先下降后上升,接种后24 h迅速降低至14.89 nmol/g,显著低于野生型和转化空载体植株的;转基因烟草的脯氨酸含量在接种前后均显著高于野生型和空载体转化植株的。接菌前,转EuAFP1.2烟草中PR1a和PR2的表达量高于野生型和空载体转化植株的,分别为野生型的2.43倍和1.2倍,空载体的2.63倍和1.27倍,PR5表达量无显著差异。接菌24 h后,转EuAFP1.2烟草中的PR1a和PR2基因表达上调,且显著高于野生型和空载体转化植株的;PR5基因被诱导表达。说明EuAFP1.2基因的过表达可减小烟草植株病斑面积,提高烟草清除活性氧的能力及植株中病程相关蛋白基因的表达,从而增强植株对小孢根霉的抑制作用,提高植株的抗真菌病害能力。

SCN2A基因介导的癫痫及其治疗研究进展

SCN2A(sodium channel,voltage-gated,typeⅡ,alpha)基因编码的神经元电压门控钠通道Na V1.2是中枢神经系统表达的四个钠通道类似物之一,参与一系列神经元动作电位的启动和传导。SCN2A基因的功能障碍与多种神经发育障碍性疾病相关,被认为是婴儿期癫痫、孤独症谱系障碍和智力障碍的重要原因之一,其基因突变类型和临床表型之间有很强的相关性,通过改变其编码的钠通道功能可以缓解癫痫发作。该文就近年来对SCN2A基因介导的癫痫的相关研究进行阐述,并总结其临床特征,为治疗提供了新思路。