盐胁迫下小偃麦酵母双杂交文库构建及TtLEA2-1互作蛋白筛选

【目的】构建小偃麦酵母双杂交(Y2H)文库,筛选胚胎发育晚期丰富蛋白(TtLEA2-1)的互作蛋白,为探究该基因的功能和表达调控机理提供理论参考。【方法】以小偃麦Y1805为材料,经提取RNA、分离mRNA、cDNA合成和均一化(DSN)处理后进行BP(attB和attP位点)重组反应,把重组产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,构建cDNA初级文库。抽提初级文库质粒,以pGADT7-DEST载体进行LR(attL或attR位点)重组反应,再转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,构建Y2H文库。【结果】对初级文库和Y2H文库进行质量分析,其滴度分别是3.98×10^(6) CFU/mL和6.14×10^(6) CFU/mL,库容量分别为7.96×10^(6) CFU和1.23×10^(7) CFU,重组率均为100%。从Y2H文库中挑取的24个单克隆的插入片段长度为850~4000 bp,平均片段长度大于1000 bp。采用Y2H技术和回转验证试验,从小偃麦Y2H文库中筛选了48个可能与TtLEA2-1互作的蛋白。48个TtLEA2-1互作蛋白中,有7个互作蛋白富集在遗传信息处理通路,4个蛋白富集在蛋白质家族:遗传信息过程通路,4个蛋白富集在核苷酸代谢通路,3个蛋白富集在甘氨酸生物合成和代谢通路,2个蛋白富集在碳水化合物代谢通路;富集在蛋白质家族:代谢、细胞过程、环境信息处理、氨基酸代谢通路的蛋白各有1个。【结论】构建的Y2H文库质量高、完整性好和覆盖面广,成功用于小偃麦盐胁迫响应基因互作蛋白的筛选试验,也为新基因发掘及其表达调控机理研究提供高效、便捷途径。