人Tum-5基因逆转录病毒载体及包装细胞株的构建

目的构建携带Tum-5基因的逆转录病毒载体并对其进行包装,获得稳定的产毒细胞系。方法采用RT-PCR法从胎肾组织中扩增Tum-5基因片断,并将其定向克隆到逆转录病毒载体pLXSN中进行PCR、双酶切和测序鉴定。利用电穿孔方法将获得的重组质粒转染PA317细胞,经G418筛选抗性克隆,收集病毒上清后感染NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果PCR、酶切证实Tum-5基因克隆至逆转录病毒载体pLXSN,Tum-5基因测序结果和原始序列相同。重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞,RT-PCR证实转染后的PA317细胞上清液中存在携带人Tum-5基因的病毒RNA,病毒滴度为2.05×104cfu/m。l结论成功的构建了携带人Tum-5基因的逆转录病毒载体,获得了稳定的产毒细胞系。

PcDNA3.1-Tum-5基因真核表达载体的构建

目的构建携带Tum-5基因真核表达载体PcDNA3.1-Tum-5。方法利用巢式PCR扩增人胚肾细胞株HEK293 cDNA获得Tum-5基因,并利用DNA回收试剂盒进行回收;同时扩增、提取pcDNA3.1质粒,并将其与Tum-5基因分别进行EcoRV和XhoI双酶切,回收相应条带,通过T4DNA连接酶进行连接,转化DH5α感受态细胞,获得阳性克隆。获得质粒DNA后行KpnI和XhoI双酶切,克隆并测序酶切产物。结果巢式PCR扩增出的产物与目的基因大小相同;重组质粒经双酶切电泳分析,与预期结果一致;对连接点两端进行测序,结果显示接头两端序列连接正确,插入序列与载体读码框架相匹配。结论本方法可以成功构建人Tum-5基因表达载体,为进一步研究Tum-5基因功能提供了理论依据。