Cell cycle analysis by cyclin E+A/DNA multiparameter flow cytometry in exponential growth MOLT-4 cells

Objective To establish a new method for analyzing the cell cycle in tumor which is a kind of cell cycle disease.Methods Mixtures of cyclin E and cyclin A antibodies were incubated with fixed MOLT-4 cells, and measured by flow cytometry.Results We developed a cyclin E+A/DNA flow cytometry analysis method, which may distinguish G0, early G1, late G1, S, G2 and M phase cells, rather than three phases in the DNA content histogram.Conclusion Cyclin E+A/DNA multiparameter flow cytometry can simultaneously differentiate in the same sample six cell groups: G0, early G1, late G1, S, G2 and M phase cells. It performed better than any other cell cycle analysis methods that we have used and has a definite cell biology foundation.

人脑胶质瘤干细胞SHG-44s的克隆及初步鉴定

目的:探讨人脑胶质瘤体外细胞系中存在肿瘤干细胞的可能性。方法:将SHG44细胞系和SHG44-9细胞株,分别应用含血清培养基(DMEM+10%FCS)和无血清培养基(DMEM/F12,添加bFGF、LIF和EGF)培养。用CD133免疫磁珠分离干细胞、Hoechst33342和NESTIN流式细胞仪、Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色检测肿瘤干细胞及其分化细胞。结果:CD133磁珠分离得到的干细胞的比例:在血清组SHG44和SHG44-9分别为0.021%和0.035%;无血清组分别为1.2%和2.3%。而Hoechst33342和CD133标记后流式细胞仪检测干细胞比例:血清组中SHG44、SHG44-9分别为1.5%、0.37%;无血清组分别为16.4%和29.1%。并且这些细胞能够增殖和分化成神经元和胶质细胞。而Nestin标记后SHG44、SHG44-9中分别有51.05%、77.53%阳性细胞。结论:体外长期传代培养的人脑胶质瘤细胞系中存在肿瘤干细胞SHG44s,CD133磁珠和Hoechst33342流式细胞仪分离和检测胶质瘤干细胞是行之有效的方法,而Nestin+细胞是干细胞分化后的祖细胞或前体细胞,不能作为分离和检测干细胞特异性标记物使用。

碱性成纤维细胞生长因子诱导表皮细胞去分化的初步研究

目的初步探索表皮细胞体外去分化模型的建立方法。方法HEKa细胞体外培养6～7代时开始出现老化迹象,细胞体积膨大,形态发生明显改变。加入浓度为100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth fac-tor,bFGF)诱导液分别培养6、12、24、48、72h后,MTT法检测bFGF对表皮细胞体外生长的促进作用。同时采用免疫细胞化学染色法、流式细胞检测技术、RT-PCR法检测bFGF诱导培养后,表皮细胞的表型及功能的改变。结果MTT检测结果显示浓度为100ng/ml,诱导时间为36～48h为诱导表皮细胞去分化的最佳实验条件。在bFGF的作用之下,老化的HEKa细胞周围开始出现新生的表皮干细胞样克隆。免疫细胞化学检测结果表明,实验组细胞中β1整合素、CK19、CK14的表达增强,而CK10作为终末分化细胞的标志,在bFGF诱导组中的表达明显降低。流式细胞检测分析显示bFGF作用后,实验组CK19表达阳性的细胞与对照组相比明显增多(分别为74.77%和15.74%);CK14表达阳性的细胞也由原来的67.26%增加至被检测细胞总数的87.14%。而bFGF诱导作用后,被检测细胞中表达CK10阳性的细胞数量较对照组明显下降(分别为4.56%和98.56%)。此外,RT-PCR检测结果同样再次支持了表皮细胞去分化的理论。在bFGF诱导组中,β1整合素、CK19、CK14mRNA转录水平明显上调,而CK10mRNA表达则明显下降。结论bFGF能够在体外诱导表皮细胞逆转分化形成幼稚型表皮前体干细胞,但其涉及具体机制需要进一步研究。

新生SD大鼠心肌干细胞的体外分离培养与鉴定

目的自新生大鼠心脏中分离得到心肌干细胞,体外培养并观察其向心肌细胞分化的能力。方法无菌操作取下新生鼠心脏,经反复消化后,弃去消化液,所得残余组织块进行培养,视生长情况进行传代。传代细胞采用诱导分化培养液进行培养,细胞生长至镜下可见搏动细胞时,分别对原代细胞和传代细胞进行流式细胞鉴定及免疫组化染色。结果从消化后残留心肌组织块中成功培养出原代细胞,经流式细胞仪鉴定其表型为c-kit、CD31阳性,CD34、CD45阴性,心肌钙蛋白T(CTnT)阴性。细胞经传代培养两周后,单个细胞开始出现搏动,亦可见成团细胞的同步收缩。再次流式鉴定,表型有所改变,主要是CD31转阴性,CTnT阳性,而c-kit、CD34、CD45无明显变化。免疫组化再次证实,原代细胞并不表达心肌细胞结构蛋白CTnT,而在部分传代细胞内可见CTnT表达。结论成功自心脏中分离得到一类表型为c-kit+CD31+CD34-CD45-CTnT-的细胞,经使用不同成分培养液传代培养,可分化为可搏动的心肌细胞,并表达心肌结构蛋白。

人胆囊癌GBC-SD细胞系中干细胞样SP细胞群的分离及其ABCG2的表达

目的探索在人胆囊癌GBC-SD细胞系中是否存在具有干细胞特性的SP细胞（side population cells）群。方法采用荧光激活细胞分选技术（FACS）分选出人胆囊癌SP细胞、非SP细胞。培养3～5周后再次进行FACS，用以检测SP细胞的分化情况。利用流式细胞术检测ABCG2蛋白在SP细胞的表达。结果SP细胞群在人胆囊癌GBC-SD细胞中占（0．64±0．08）％，分离出的SP细胞在培养3～5周后会产生SP细胞和非SP细胞，而非SP细胞则不具备此特性；并且ABCG2在胆囊癌SP细胞群中呈现出高表达状态[（89．56±3．86）％]，在非SP细胞中几乎不表达[（1．32±0．49）％]，两者之间的差异具有统计学意义（P〈0．01）。结论人胆囊癌GBC-SD细胞系中存在着很少量的干细胞样SP细胞群，并且高表达ABCG2。

去分化来源表皮干细胞的分离与鉴定

目的分离培养和鉴定去分化来源的表皮干细胞。方法采用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导表皮细胞去分化形成表皮干细胞,采用Ⅳ型胶原黏附法分离获得去分化来源的表皮干细胞。观察去分化来源表皮干细胞的形态及增殖特点,并通过免疫细胞化学、免疫荧光及流式细胞技术对其形态和表型进行鉴定。结果去分化来源的表皮干细胞能够表达表皮干细胞及其亚群特异性的表面标志蛋白,如β1整合素、CK19、CK14等,而CK10的表达为阴性。激光共聚焦检测显示α6整合素和CD71在去分化来源表皮干细胞及其亚群中的分布均存在着区域性差异。此外,流式细胞检测结果显示去分化来源的表皮干细胞中主要包含α6+CD71-和α6+CD71+的两种细胞群落,分别占被检测细胞总数的24.52%±7.88%及66.97%±5.04%。结论去分化来源的表皮干细胞与机体自身来源的表皮干细胞在形态和表型上具有相似性,可以作为表皮干细胞的替代细胞应用于皮肤重建与再生的相关研究。

流式细胞术检测结直肠癌根治术前后循环肿瘤细胞和循环肿瘤干细胞及其临床预测价值

目的:探讨流式细胞仪检测结直肠癌根治术前后循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)和循环肿瘤干细胞(circulating tumor stem cell,CTSC)作为患者临床预测指标的可行性和临床价值。方法:入组首诊初治50例结直肠癌患者,手术前后各抽取15 ml外周血。分离单个核细胞后分成两份,一份标记CTC标志物(CD45、Ep CAM和CK),另一份标记CTSC标志物(CD45、Ep CAM、CD44和CD133),Moflo XDP流式细胞仪对其进行检测,CD45-Ep CAM^+CK^+细胞确定为CTC;CTSC确定为3群:CD44^+CTSC、CD133^+CTSC和CD44^+CD133^+CTSC。结果:结直肠癌根治术前患者CTC和CD44^+CTSC阳性率分别为34%和44%,CD133^+CTSC和CD44^+CD133^+CTSC是24%和0;术后患者CTC和CD44^+CTSC阳性率分别为38%和54%,CD133^+CTSC和CD44^+CD133^+CTSC分别为26%和0。根治术前后CTC阳性率都与肿瘤T分期有关联(P<0.05);术后CTC与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移和远处转移有关联(P<0.05);术前CD44^+CTSC与肿瘤的浸润深度有关联。结论:根治术前后CTC及术前CD44^+CTSC阳性率都具有临床预测指标的可行性和价值,术后CTC阳性率可能是更好的预测指标。

成年SD鼠骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化过程中分化与凋亡关系的研究

目的 :探讨体外诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化过程中分化和凋亡间的关系 ,为进一步延长神经元样细胞的存活提供理论和实验依据。方法 :采用全骨髓法分离培养成年SD鼠骨髓基质干细胞至第 5代 ,以 β-巯基乙醇 (1mmol/L)及维甲酸 (RA ,1 0 - 6 mol/L)诱导分化 ,于诱导后 1h、3h、5h分别行神经元特异性抗原MAP- 2免疫组化鉴定 ,并计数神经元样细胞数 ,计算分化率。核荧光染料DAPI检测诱导后 5h和 2 4h细胞核的凋亡特异性形态学改变 ,流式细胞仪对细胞凋亡峰的分析检测诱导后 1h、3h、5h细胞凋亡率。结果 :成年鼠骨髓基质干细胞经 β -巯基乙醇 (1mmol/L)及维甲酸 (RA ,1 0 - 6 mol/L)诱导 30min后可见神经元样细胞出现 ,经MAP - 2免疫组化鉴定 ,此类细胞呈阳性 ,诱导后 1h、3h、5h神经元样细胞分化率分别为 41 %、44 %、73 %和 2 4 %、37%、61 %。但诱导后 5h见细胞漂浮并死亡 ,此时DAPI染色显示部分细胞核浓缩 ,出现核碎片。流式细胞仪检测经 β -巯基乙醇诱导后 1h、3h、5h细胞的凋亡率分别为 1 .5 %、6 .1 %、2 1 .5 % ,经RA诱导后的凋亡率分别为 1 .5 %、1 .7%、1 2 .3 %。结论 :①β -巯基乙醇及RA诱导骨髓基质干细胞分化成为神经元样细胞的能力不同。

口腔鳞癌患者外周血及癌组织中IL-17和Foxp3的表达及意义

目的探讨口腔鳞癌患者外周血及癌组织中IL-17和Foxp3的表达及意义。方法选取40例原发初诊经病理证实的口腔鳞状细胞癌患者为实验对象,术前流式细胞术测定外周血中IL-17与Foxp3所占比例及CD3、CD4、CD8、CD56的表达。组织标本为术中立即取材,SP法测定IL-17及Foxp3表达。选取20例良性肿瘤患者瘤旁正常口腔黏膜作组织对照。实验分为A(Ⅰ、Ⅱ期鳞癌患者)、B(Ⅲ、Ⅳ期鳞癌患者)、C(健康者)三组进行组间比较。结果 A、B组外周血CD4+IL-17+细胞、CD4+Foxp3+细胞所占比例均显著高于C组,IL-17+、Foxp3+的表达水平呈正相关(r=0.772,P<0.0 5),其中B组C D 4+I L-1 7+、CD4+Foxp3+细胞所占比例高于A组(P<0.05)。与C组相比,A、B组外周血中CD3+和CD4+细胞的百分率、CD4+/CD8+的比值降低,CD8+细胞的百分率升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。IL-17、Foxp3在A、B组中阳性率均明显高于C组,在A组中阳性表达率低于B组,差异均有统计学意义(P<0.05),且A、B组癌组织中IL-17与Foxp3的表达水平呈正相关(r=0.386,P<0.05)。结论 IL-17及Foxp3在口腔鳞癌的发生发展中起着一定的促进作用,这种作用可能与机体免疫状态有关。

人胆囊癌SP细胞的分离及其干细胞标记物的表达

目的:探索在人胆囊癌GBC-SD细胞系中是否存在具有干细胞特性的SP细胞(side population cells),以及SP细胞、非SP细胞和GBC-SD细胞系表达常见干细胞标记物ABCG2、Oct-4、CD34的情况。方法:采用荧光激活细胞分选技术(FACS)分选出人胆囊癌SP细胞和非SP细胞,通过RT-PCR、Western blot、流式细胞术以及免疫荧光化学技术检测SP细胞、非SP细胞以及GBC-SD细胞系表达ABCG2、Oct-4和CD34的情况。结果:人胆囊癌GBC-SD细胞系中存在着少量的具有干细胞潜能的SP细胞,其所占的比例为(0.64±0.08)%,SP细胞相对于非SP细胞和GBC-SD细胞,具有更强的体外侵袭力(P<0.05);并且ABCG2在胆囊癌SP细胞中呈现出高表达的状态(89.56±3.86)%,在非SP细胞中几乎不表达(1.32±0.49)%,在未分选胆囊癌细胞系中ABCG2呈弱表达(12.37±1.61)%,P=0.001;Oct-4在三种细胞中的表达分别为:(94.87±1.40)%、(88.16±2.34)%、(90.17±1.61)%,P>0.05;CD34在mRNA水平高表达于非SP细胞和GBC-SD细胞,不表达于SP细胞;在蛋白水平几乎均不表达于这三种细胞,其含量依次为:(1.78±0.51)%、(0.63±0.21)%、(0.96±0_38)%,P>0.05。结论:人胆囊癌GBC-SD细胞系中存在具有干细胞特性的SP细胞,并且具有ABCG2^+Oct-4^+CD34^-的表型特征。

脑肿瘤干细胞的增殖活性与病理级别的相关性研究

目的检测增殖细胞核标记物Ki-67与脑肿瘤干细胞(BTSCs)标记物CD133、Nestin在60例脑胶质瘤组织中的表达,探讨BTSCs的增殖活性与病理级别的相关性。方法采用免疫组织化学SP法检测CD133、Nestin和Ki-67在60例胶质瘤组织中的表达;采用免疫荧光双染法检测Ki-67、CD133和Nestin之间的共表达情况。计算两种方法中CD133+细胞、Nestin+细胞和Ki-67+细胞所占的百分率,并将Ki-67+细胞与CD133+细胞、Nestin+细胞和肿瘤病理分级分别进行相关性分析。结果按照WHO 2000的神经系统肿瘤分类分级标准所有标本分为Ⅱ级18例,Ⅲ级23例,Ⅳ级19例,在不同的病理级别组中,CD133+、Nestin+和Ki-67+细胞的表达有明显差异,并且免疫荧光双染相比免疫组化单染更能代表BTSCs的增殖活性研究。在免疫荧光共表达中,随着病理级别的升高,CD133+/Ki-67+细胞(F=30.668,P=0.000)或Nestin+/Ki-67+细胞(F=15.316,P=0.000)的百分比差异都有显著性,并且同时均与CD133+/Nestin+BTSCs的表达成正相关。结论Ki-67+指标与肿瘤级别成正相关,可以作为预后判断的指标,同时与BTSCs标记物CD133、Nestin的表达之间也有明显的相关性,并且,免疫荧光双染得出的BTSCs的增殖活性与病理级别的相关性研究更有统计学意义。

罗丹明123分离肝癌细胞系HepG2异质性亚群的鉴定

目的:建立分离肝癌细胞系HepG2中对罗丹明123(Rho123)染料具有不同排斥能力细胞亚群的方法,并探讨其在肝癌异质性研究中的意义.方法:利用流式细胞分选术(FCM)并结合不同浓度的Rho123染料,分析和分选肝癌细胞系HepG2细胞中具有不同染料排斥能力的肝癌细胞亚群,再通过细胞生长的测定、软琼脂克隆形成以及免疫组织化学检测和裸鼠成瘤实验等方法,以比较不同肝癌细胞亚群的差异.结果:根据不同染料排斥能力可以将肝癌细胞系HeDG2细胞分为Rho^(low)和Rho^(high)2个亚群,2个亚群在倍增时间(16.9 h vs 24.7 h)、最大增生倍数(15.2 vs 12.3)、克隆形成率(50% vs 20%)以及甲胎蛋白(AFP)的表达(31/32 vs 20/26)以及裸鼠成瘤实验(7/10 vs 1/10)上具有显著性差异(均P<0.01),Rho^(low)亚群是具有干细胞特性的.结论:Rho123结合FCM可以富集具有干细胞特性的Rho^(low)亚群,同时进一步证实肝癌的异质性.

ABCG2在肝细胞性肝癌组织和肝癌细胞株中的表达及意义

目的:探讨干细胞标志物ABCG2在肝细胞性肝癌组织和肝癌细胞株中表达的意义.方法:应用免疫组化SP方法检测ABCG2在30例肝细胞性肝癌组织和8例癌旁肝硬化组织中的表达、分布,并采用细胞免疫荧光技术检测ABCG2在两种肝癌细胞株HepG2、PLC/PRF/5中的表达,采用流式细胞技术测试出两种细胞株中ABCG2阳性细胞的比例.结果:免疫组化中,ABCG2阳性染色定位于癌细胞胞膜,部分病例胞质也有分布.免疫组化显示ABCG2在肝细胞性肝癌组织和癌旁肝硬化组织中的表达阳性率分别为63.33%(19/30)和25%(2/8).ABCG2蛋白在HepG2、PLC/PRF/5这两个肝癌细胞株中均有表达,HepG2中,ABCG2阳性染色定位于细胞胞质中,而在PLC/PRF/5中,ABCG2阳性染色定位于细胞胞质和细胞膜上.PLC/PRF/5细胞株中,通过流式细胞仪能检测出表达ABCG2的细胞(P<0.05),而在HepG2细胞株中,通过流式细胞仪不能检测出表达ABCG2的细胞.结论:ABCG2在肝细胞性肝癌的发生发展过程中可能起着非常重要的作用,有可能成为临床治疗肝细胞性肝癌的分子靶标.

调节性T细胞在口腔鳞癌患者外周血及癌组织中的表达和意义

目的探讨CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)在口腔鳞癌患者外周血及癌组织中的表达和意义。方法选取初诊的30例口腔鳞癌患者,按临床分期分为A、B两组,A组为Ⅰ、Ⅱ期患者,B组为Ⅲ、Ⅳ期患者,10例健康志愿者为对照组(C组)。分别采集三组受试对象晨起空腹外周血3 ml,采用流式细胞术测定外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞、CD80、CD86和HLA-DR的表达情况;取试验组及对照组手术标本,利用免疫组织化学法测定Foxp3+调节性T细胞的浸润情况。结果 CD4+CD25+Foxp3+T淋巴细胞占CD4+T淋巴细胞比例在三组中分别为(2.80±0.90)%(A组)、(5.09±1.72)%(B组)、(0.57±0.1 5)%(C组),组间比较差异具有统计学意义(P=0.000)。A、B组外周血中单个核细胞表面共刺激分子CD80+CD86+、CD80+HLA-DR+及CD86+HLADR+细胞的表达明显低于C组;CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞所占比例与CD80+CD86+、CD80+HLA-DR+和CD86+HLA-DR+表达率进行直线相关分析,相关系数分别为-0.512、-0.430、-0.461,均有统计学意义。免疫组织化学结果显示,Foxp3在口腔鳞癌组织中主要分布在黏膜固有层肿瘤间质,其中Foxp3+调节性T细胞在高分化和中分化口腔鳞癌中少,在低分化口腔鳞癌中多,两者间差异有统计学意义。结论检测口腔癌患者外周血和肿瘤组织中CD4+CD25+Foxp3+调节性T胞,有助于对机体抗肿瘤免疫水平、病变进展情况和肿瘤预后进行评估,为临床生物治疗提供佐证。

人喉癌组织及喉癌细胞系肿瘤干细胞表面标记的差异

目的比较细胞膜表面蛋白CD44、ABCG2(ATP-binding cassette superfamily G2,ABCG2)和CD133在人喉鳞状细胞癌(简称喉癌)组织及喉癌Hep-2、LSC-1细胞系中的表达及其差异性,从而探讨在喉癌肿瘤干细胞筛选中的价值。方法以人喉癌组织及喉癌细胞系Hep-2、LSC-1为研究对象,应用流式细胞仪检测CD44、ABCG2和CD133在人喉癌组织及喉癌细胞系中的表达情况。结果 CD44在喉癌组织中表达个体差异性较大,在喉癌细胞系中稳定高表达。喉癌组织与喉癌细胞系中表达量不同,ABCG2在喉癌组织中阳性表达、Hep-2中呈弱阳性表达、LSC-1中呈高表达,在喉癌组织与喉癌细胞系Hep-2中表达差异无统计学意义。CD133在喉癌组织中阳性表达,在喉癌细胞系中呈弱阳性表达,且喉癌组织与喉癌细胞系表达差异无统计学意义。结论 CD44、ABCG2及CD133在喉癌组织与喉癌细胞系中的表达存在明显差异。

转化生长因子-β1和丹参酮ⅡA联合诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)与丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA)联合诱导对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)定向分化为心肌样细胞的影响。方法采用全骨髓贴壁法从10只SD大鼠四肢骨中分离、培养BMSCs,流式细胞术对培养的细胞进行鉴定。对第2代BMSCs作定向诱导,根据加入诱导剂的不同分为TGF-β1组、tanshinoneⅡA组、两者联合诱导组及实验对照组(不加任何诱导剂)。诱导72h后更换为常规培养基继续培养,相差显微镜观察培养细胞的形态学变化;各组培养4周后,应用免疫细胞化学染色法检测原肌球蛋白(TPM)、缝隙连接蛋白43(Cx43)以及心肌肌钙蛋白I(c Tn I)的表达情况;实时定量PCR(Real-time PCR)法检测各组BMSCs在诱导培养的第1、2、4周心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2.5的表达情况;透射电子显微镜观察分化细胞的超微结构变化。结果实验对照组细胞TPM、Cx43及c Tn I均为弱阳性或阴性表达。与实验对照组相比,TGF-β1组、TanshinoneⅡA组及两者联合诱导组BMSCs以上各标记物的阳性表达均明显升高,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。其中,两者联合诱导组各标记物的阳性表达均显著高于TGF-β1及TanshinoneⅡA单独诱导组。Real-time PCR结果显示,在诱导第1周时TGF-β1组、TanshinoneⅡA组及两者联合诱导组GATA-4及Nkx2.5基因表达均最强,随后表达减弱至不表达。1周时,联合诱导组GATA-4 mRNA相对表达量是实验对照组的3.7倍,Nkx2.5 mRNA相对表达量是实验对照组的2.9倍,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。透射电子显微镜结果显示,各诱导组均可见分化的细胞呈杆状,胞核卵圆形,位于细胞中央,胞质中可见平行排列的肌丝、粗面内质网和线粒体等细胞器。结论 TGF-β1、tanshinoneⅡA均可分别及联合诱导BMSCs获得心肌分化表型,且两者联合诱导效果优于单一诱导。

热休克汗腺细胞诱导人骨髓间充质干细胞的表型转化

背景:未休克汗腺细胞与骨髓间充质干细胞的共培养和休克汗腺细胞与骨髓间充质干细胞的直接共培养均对骨髓间充质干细胞的表型改变无影响。目的:在体外建立热休克汗腺细胞模型和骨髓间充质干细胞与汗腺细胞间接共培养体系;分析共培养前后骨髓间充质干细胞的形态学、细胞表型的变化情况,探讨骨髓间充质干细胞向汗腺细胞分化的可行性。方法:体外分别分离培养、扩增并鉴定骨髓间充质干细胞和汗腺细胞,建立汗腺细胞体外热休克模型,继续孵育3-5d,收集上清液作为条件培养基对骨髓间充质干细胞分化诱导,对比共培养5,10d骨髓间充质干细胞形态学变化;应用免疫组织化学和流式细胞仪法检测对比共培养10d后骨髓间充质干细胞细胞表型的改变。结果与结论:①骨髓间充质干细胞表面标志CD29、CD44、CD105阳性,汗腺细胞表面标志CK7、CK8、CK18、CK19、CEA阳性。②骨髓间充质干细胞诱导分化后细胞表型的改变:被诱导的细胞中CEA、CK7、CK8和CK19染色阳性,而对照组没有检测到CEA、CK7、CK8和CK19染色阳性的细胞;流式细胞仪检测CEA、CK7、CK8和CK19的阳性率分别是60.67%,53.34%,54.11%和58.62%。说明实验成功诱导骨髓间充质干细胞,并获得汗腺细胞表型;通过建立适当的体外汗腺诱导培养体系,中胚层的骨髓间充质干细胞可以通过跨胚层分化途径转变为汗腺细胞。

依达拉奉体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的采用密度梯度离心和差速贴壁法体外分离、培养、纯化及鉴定成年Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和依达拉奉联合诱导MSCs定向分化为神经元样细胞。方法选用1月龄健康雄性Wistar大鼠,采用Percoll分离液密度梯度离心法获取骨髓中的MSCs,通过差速贴壁法反复传代培养、纯化,取第3代细胞采用流式细胞术、免疫细胞化学等方法检测MSCs的纯度,利用bFGF联合依达拉奉诱导MSCs向神经元样细胞分化,并通过扫描电镜、免疫细胞化学等对诱导后的细胞进行鉴定。结果第3代MSCs经免疫细胞化学及流式细胞仪等检测,间充质干细胞特异性的标记物CD44表达阳性,不表达造血干细胞及白细胞的特异性标记物CD34、CD45,MSCs纯度高达95.5%。诱导分化后扫描电镜检测可观察到典型的神经元样细胞结构;免疫细胞化学检测发现,细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE),不表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP),Nestin的表达随着细胞成熟而减弱。结论密度梯度离心和差速贴壁法可获得高纯度的MSCs;依达拉奉能高效地定向诱导MSCs分化为神经元样细胞。

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及DiI荧光标记

目的:探讨兔骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法。方法:采用密度梯度离心法及贴壁分离筛选法分离培养MSCs;采用免疫细胞化学方法检测细胞表面标志抗原CD29和CD106的表达,进行表型鉴定;DiI标记第3代MSCs,观察标记效率。结果:体外培养的原代MSCs48h内可见少量贴壁细胞,7～8d达到90%汇合;免疫细胞化学方法检测细胞表面标志抗原CD29,CD106为阳性;DiI进行细胞标记后,荧光显微镜下见所有MSCs均被标记为红色荧光,敏感性好,标记效率高。结论:此培养方法可以作为培养兔MSCs的常规方法,为构建组织工程尿道提供充足的种子细胞。

二烯丙基三硫对人白血病HL-60细胞凋亡作用的实验研究

目的研究二烯丙基三硫对HL-60细胞凋亡的影响及其作用机制。方法将浓度为30 mg/L的二烯丙基三硫与HL-60细胞体外共培养48小时后,采用Wright染色在光学显微镜下观察细胞形态学变化;以流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡率;应用免疫组化方法检测细胞内Bcl-2、survivin蛋白的表达。结果光镜下可见二烯丙基三硫作用后细胞形态出现凋亡的形态特征,空白对照和30 mg/L的二烯丙基三硫分别与HL-60细胞作用48小时,细胞的凋亡率分别为(12.42±0.76)%和(60.57±3.24)%(P<0.05),二烯丙基三硫组HL-60细胞的Bcl-2、survivin蛋白呈弱阳性或阴性表达,而对照组均阳性表达。结论二烯丙基三硫促进HL-60细胞的凋亡的机制,可能是通过抑制Bcl-2、survivin蛋白的表达。