米非司酮对子宫内膜异位症细胞PTEN基因表达与凋亡的影响

目的:探讨米非司酮对子宫内膜异位症细胞PTEN基因表达及凋亡的影响。方法:体外原代培养人异位子宫内膜细胞,应用四甲基偶氮噻唑兰(MTT)法测定子宫内膜异位症细胞体外增殖活性;应用流式细胞仪(FCM)检测在不同浓度米非司酮作用24h后,子宫内膜异位症细胞PTEN蛋白表达率、增殖率和凋亡率;应用吖啶橙荧光染色法和透射电镜技术研究子宫内膜异位症细胞的形态学变化。结果:米非司酮能够抑制子宫内膜异位症细胞的增殖且呈明显的剂量依赖性;AO荧光染色及透射电镜观察表明,经米非司酮培养的子宫内膜异位症细胞出现了典型的细胞凋亡的特征性变化;米非司酮能够使子宫内膜异位症细胞出现细胞周期阻滞,使其停滞于G1 期,降低S期细胞比例;PTEN蛋白的表达率明显增加,与对照组相比差异显著。结论:米非司酮能够明显抑制人异位子宫内膜细胞的体外增殖并促进其凋亡,其促凋亡作用与上调PTEN基因的表达有关。

PTEN抑癌基因转染粘液表皮样癌细胞系M_3SP_2的建立和鉴定

目的 :为了研究外源性基因PTEN对粘液表皮样癌细胞生物学行为的影响 ,建立稳定表达PTEN的粘液表皮样癌细胞系。方法 :应用脂质体介导方法将野生型PTEN基因导入高转移性粘液表皮样癌细胞系M3 SP2 ,嘌呤霉素筛选阳性克隆 ,用免疫印迹法和ABC免疫酶染色法检测转染细胞中PTEN蛋白的表达。结果 :野生型PTEN基因成功地导入细胞M3 SP2 ,转染细胞稳定表达PTEN蛋白 ,PTEN蛋白分布于细胞质。结论 :M3 SP2 细胞能稳定表达外源性基因PTEN。

外源性PTEN基因诱导黏液表皮样癌细胞系凋亡的研究

目的：探讨转染外源性PTEN抑癌基因对黏液表皮样癌细胞系M3SP2的诱导凋亡作用。方法：用含野生型PTEN抑癌基因逆转录病毒载体转染高转移性涎腺黏液表皮样癌细胞系M3SP2,转染空载体亲本细胞为对照细胞。体外细胞凋亡采用苏木精-伊红染色、电镜、TUNEL染色和流式细胞仪检测,裸鼠移植瘤细胞凋亡应用苏木精-伊红染色形态学判定。Bc l-2、P53和H-ras蛋白表达用免疫组化染色检测。结果：试验细胞M3SP2-PTEN与对照细胞M3SP2-pBp比较,出现较多的典型的凋亡细胞特征。试验细胞和对照细胞凋亡率分别为7.5%-13.6%和1.2%-2.3%;裸鼠移植瘤M3SP2-PTEN组和M3SP2-pBp组的凋亡指数分别为17.4%和3.5%。免疫组化染色显示M3SP2-PTEN细胞与对照细胞比较,P53蛋白表达增强,Bc l-2和H-ras蛋白表达减弱。结论：外源性PTEN抑癌基因能显著诱导高转移性涎腺黏液表皮样癌细胞凋亡,并且与P53、Bc l-2和H-ras蛋白表达有一定关系。

PTEN抑癌基因对人黏液表皮样癌细胞系增殖和细胞周期的影响

目的:探讨外源性PTEN抑癌基因对唾液腺黏液表皮样癌细胞系增殖抑制的机制。方法:将含野生型PTEN抑癌基因cDNA重组反转录病毒表达质粒导入高转移性唾液腺黏液表皮样癌细胞系M3SP2,转染空载体细胞为对照。MTT比色法测定细胞增殖,流式细胞术测定细胞周期,免疫组化染色检测PCNA、EGFR、CDK4、P16INK4a和P57Kip2蛋白表达。采用SPSS11.0软件包进行统计学分析。结果:与对照细胞比较,PTEN基因转染癌细胞M3SP2-PTEN对表皮生长因子(EGF)介导的细胞增殖具有显著的抑制作用,癌细胞阻滞在G0/G1期,PCNA、EGFR、CDK4以及C-myc蛋白表达减弱,而P16INK4a和P57Kip2蛋白表达增强(P<0.05)。结论:外源性PTEN基因具有抑制唾液腺黏液表样癌皮细胞系EGF介导的增殖作用,其作用机制与细胞周期进程受阻以及细胞周期调控分子有关。

PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系生物学行为的影响

目的 探讨外源野生型PTEN抑癌基因对人高转移性黏液表皮样癌细胞系M3SP2体外黏附、迁移和侵袭特性的影响。方法 用脂质体介导方法将PTEN抑癌基因导入M3SP2细胞系 (M3SP2 -PTEN细胞 ) ,转染空载体的细胞系作为对照(M3SP2 -pBp细胞 ) ,分别用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法、细胞迁移试验及细胞侵袭试验测定M3SP2 -PTEN细胞和M3SP2 -pBp细胞体外黏附、迁移和侵袭能力。结果 M3SP2 -PTEN细胞在Metrigel和Fn基质上黏附数量减少 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 0 1) ,黏附抑制率分别为 34 3%和 4 9 4 %。M3SP2 -PTEN细胞在Matrigel基质上迁移距离小 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 0 5 ) ,迁移抑制率为 2 6 0 %。M3SP2 -PTEN细胞体外侵袭细胞数量减少 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 0 1) ,侵袭抑制率为 31 4 %。结论 外源性PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系M3SP2体外黏附、迁移和侵袭具有抑制作用。

PTEN抑癌基因对黏液表皮样癌实验性裸鼠肺转移的抑制作用

目的 探讨外源野生型PTEN抑癌基因对人高转移性黏液表皮样癌M3SP2细胞系实验性裸鼠肺转移能力的影响。方法 用脂质体介导方法将PTEN抑癌基因导入M3SP2细胞系 (M3SP2 -PTEN细胞 ) ,转染空载体的细胞系作为对照M3SP2 -pBp细胞 ) ,应用裸鼠肺转移实验测定癌细胞的体内转移能力 ,并进行组织学观察。结果 对照组裸鼠肺转移结节数为 (2 4 0± 1.2 )个 ,组织学观察瘤细胞转移灶体积大 ,细胞生长活跃 ,可见较多核分裂。实验组裸鼠肺转移结节数量减少为 (8 5± 3 4 )个 ,转移抑制率为 6 5 6 % ;组织学观察可见转移灶数量少、体积小 ,并有较多的坏死和凋亡细胞。结论 转染野生型PTEN抑癌基因能降低人高转移性黏液表皮样癌细胞转移能力。

抑癌基因PTEN在肝癌组织中的突变及其对肝癌细胞增殖和凋亡的调控作用

目的探讨抑癌基因PTEN在人原发性肝癌组织中的突变及其对肝癌细胞增殖和凋亡的调控作用。方法(1)聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性(SSCP)法和序列分析法检测42例人原发性肝癌组织中抑癌基因PTEN第5、8外显子的突变。(2)脂质体介导的基因转染法将野生型PTEN基因、突变型PTEN基因的真核表达载体pEGFP-wt-PTEN、pEGFP-PFEN;G129R分别转染不表达内源性PTEN蛋白的人肝癌细胞系HHCC,G418筛选稳定表达PTEN蛋白的克隆,MTT比色实验分析测定细胞的增殖能力。以未转染基因的HHCC细胞和转染空载体pEGFP-C1的HHCC细胞为对照。(3)TNF-α诱导上述细胞凋亡,流式细胞仪测定凋亡细胞比例;Western印迹法检测细胞内磷酸化Akt(Ser473)的表达。结果(1)在4例肝癌组织中检测出PTEN基因第5外显子的异常突变条带(9．5％,4／42)。(2)转染野生型PTEN基因的HHCC细胞生长明显抑制,而转染突变型PTEN基因的HHCC细胞的增殖能力与对照组比较差异无统计学意义。(3)TNF-α诱导分别转染野生型、突变型PTEN基因、空载体的HHCC细胞和未转染基因的HHCC细胞凋亡,细胞凋亡率分别为13．8％、8．1％、4．6％、3．3％,与转染空载体的HHCC细胞比较,转染野生型PTEN基因的HHCC细胞凋亡率增高(P<0．05);而转染突变型PTEN基因的HHCC细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0．05)。Western印迹检测显示未经基因转染的HHCC细胞内源性Akt水平较低;HHCC细胞经TNF-α作用,其内源性Akt水平增高;转染野生型PTEN基因,可降低TNF-α诱导的肝癌细胞内信号分子Akt (Ser473)的磷酸化水平。结论(1)首次发现原发性人肝癌组织中抑癌基因PTEN发生突变;(2)野生型PTEN基因可抑制肝癌细胞增殖,而突变型PTEN基因丧失对肝癌细胞增殖的调控作用;(3)野生型PTEN基因可降低TNF-α诱导的肝癌细胞内重要的信号分子Akt(ser473)的磷酸化水平,即野生型PTEN基因通过抑制TNF-α诱导的肝癌细胞Akt磷酸化(活化)而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。

外源性PTEN增强乏氧诱导胰腺癌细胞系ASPC-1的凋亡

目的研究外源性PTEN对乏氧胰腺癌细胞系ASPC-1细胞周期、血管内皮生长因子 (VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)蛋白表达及细胞增殖能力的影响。方法将质粒pEAK8和 pEAK8-PTEN分别转染ASPC-1细胞,获得ASPC-1-pEAK8(A-pE)细胞和ASPC-1-pEAK8-P-FEN(A-pE-P)细胞,给予乏氧(1％O2)处理,并应用RT-PCR、Western印迹杂交、流式细胞术、成克隆分析及观察裸鼠移植瘤生长等方法进行检测。结果A-pE-P细胞PTEN mRNA及其蛋白表达明显高于ASPC-1细胞和A-pE细胞。与ASPC-1细胞相比,常氧时,A-pE-P细胞VEGF蛋白表达量下降了23．4％,EGFR蛋白表达量无明显变化,细胞克隆形成率降低了28．0％(F=4．283,P<0．05),荷瘤裸鼠5周时,A-pE-P 细胞组和ASPC-1细胞组瘤结节体积比较,差异有统计学意义(t=4．834,P<0．01),A-pE-P细胞组的抑瘤率为42．4％。乏氧时,A-pE-P细胞VEGF蛋白表达量下降了31．4％,EGFR蛋白表达量降低了 25．0％,细胞克隆形成率降低了33．2％(F=9．152,P<0．01)。A-pE-P细胞较ASPC-1细胞G2／M期阻滞明显,乏氧培养8 h时可引起细胞大量凋亡。结论外源性PTEN使ASPC-1细胞阻滞在G2／M 期,增强乏氧诱导细胞的凋亡,抑制乏氧诱导VEGF、EGFR表达的增加,抑制肿瘤细胞的增殖。