人C-反应蛋白磁微粒化学发光酶免疫测定法的建立

人C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是炎症以及各种相关疾病如病毒感染、心血管疾病等诊断、治疗和预后的临床检测指标。为了建立一种快速、准确的CRP定量免疫测定方法,将表达纯化的重组CRP作为抗原免疫小鼠,获得了5株稳定分泌抗体的单克隆抗体细胞株,采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)初步鉴定筛选的抗人CRP单克隆抗体,并分别选择mAb 9D6和mAb 9G4作为捕获抗体与检测抗体,建立用于人CRP检测的化学发光酶免疫测定法(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA),最后通过测定分析临床血清CRP样本,评价CLEIA的性能。结果显示,基于9D6/9G4-AP单克隆抗体对的CLEIA测定范围为0.1767~500μg/L(可扩展至100 mg/L);所建立的CLEIA与医院采用的免疫散射比浊法(R^(2):0.9496,P<0.0001)表现出良好的相关性,且Bland-Altman分析中96.36%(106/110)的点在95%一致性界限范围内显示两种检测方法具有较好的一致性。结果初步表明,建立的分析方法在临床诊断中具有较好的应用前景。

不同年龄段健康儿童血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)临床评估

目的比较不同年龄段健康儿童血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性和质量差异,并对其临床合理应用进行探讨。方法选取184例健康儿童,按年龄阶段进行分组,同时选取30例健康成人设为对照组,分别采用酶免疫抑制法测定血清CK-MB活性,双抗体夹心法测定血清CK-MB质量。结果各健康儿童组和成人组CK-MB活性和质量呈明显正相关;儿童组CK-MB活性和质量随年龄增长呈下降趋势,趋近成人水平;各组质量检测均在正常参考范围,而低年龄儿童组CK-MB活性略高于临床正常值。结论临床医生在参考CK-MB活性和质量检测结果进行病情判断时,要考虑年龄因素;在临床诊断中CK-MB质量测定更优于活性测定。

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)出血病二价细胞灭活疫苗体液免疫效果及免疫保护率评价研究

草鱼出血病是由草鱼呼肠孤病毒(GCRV)引起的草鱼养殖业一种严重的病毒性出血病,给草鱼养殖产业造成重大损失。该病毒是一种双链分节段RNA病毒,根据GCRV多个病毒分离株基因序列分析及临床发病特点,共有三种基因型GCRV,其中基因Ⅰ型和Ⅱ型较为流行。通过细胞分离培养基因Ⅰ型(GCRV-ZV8909)和Ⅱ型(GCRV-HZ13)GCRV,研制出草鱼出血病二价细胞灭活疫苗,通过绝对定量的方法,测定基因Ⅰ型和Ⅱ型的病毒含量分别为2.0×109及1.5×106 copies/mL。用生理盐水将其分别进行50倍稀释和100倍稀释,包括原液及生理盐水对照共4组,分别腹腔注射免疫(20±5)g健康草鱼,剂量均为0.2 mL/尾,每组40尾,各组于免疫后3、5、7、14、21、28、42、56、70、84 d分别取3尾采集血液制备血清。分别利用经原核表达并纯化制备两种基因型GCRV的VP7蛋白以及实验室保存的草鱼IgM单抗,建立了三抗体夹心酶联免疫方法(TAS-ELISA)分析评价疫苗体液免疫效果。结果表明,草鱼经腹腔注射不同剂量的细胞灭活疫苗后,与对照组相比,各免疫组血清抗体均有不同程度的提高,且原液组与50倍稀释组基本持平,但都高于100倍稀释组,各免疫组在免疫后5 d即可检测到两种基因型GCRV抗体,且抗体水平持续到84 d,但两种基因型抗体水平达到高峰的时间不一致,抗基因Ⅰ型GCRV抗体达到高峰是在28 d,抗基因Ⅱ型GCRV抗体是在14 d达到高峰。两种基因型抗体水平达到高峰时的血清效价分别为1︰800、1︰600。免疫保护率实验结果表明,原液组保护率最高,为67%,50倍稀释组为60%,100倍稀释组只有33%。

促甲状腺素酶联免疫吸附试验在新生儿疾病筛查中的应用

目的:探讨新生儿疾病筛查中促甲状腺素(TSH)酶联免疫吸附试验操作实验的影响因素,有效控制实验结果的准确度,避免假阳性结果的出现。方法:对每次实验结果进行认真分析,总结其实验结果的影响因素。结果:通过进行TSH酶联免疫吸附试验操作实验,有效提高了实验结果的准确性,减少了实验结果的假阳性和召回率,节约了人力和物力。结论:在实际TSH酶联免疫吸附试验操作实验中的经验总结简明、实用,能有效地控制好实验的精确度,提高实验结果的准确度,适宜推广。

肺炎球菌1型荚膜多糖多克隆抗体制备与夹心ELISA法建立及其在多糖浓度测定中的应用

目的：利用肺炎球菌1型全菌体制备多克隆抗体，并且利用该抗体建立肺炎1型荚膜多糖夹心酶联免疫吸附分析法（ Enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA），用于检测发酵和纯化过程中的多糖浓度。方法用灭活的1型肺炎链球菌免疫家兔6周，获得高滴度的抗多糖血清，经过亲和层析纯化，获得高纯度的兔抗肺炎1型多糖抗体IgG。以纯化IgG作为包被抗体，加入多糖样品，再以生物素化的抗体作为检测抗体，建立夹心ELISA法检测肺炎1型多糖浓度。确定标准曲线的最佳线性范围，并对该方法进行特异性、准确性和精密度验证。结果兔免疫血清经过双向免疫扩散检测抗体滴度可达1∶32；该方法的线性检测范围为1．56～50 ng/mL；最低检测限为3．13 ng/mL。在标准品中混入其他型别多糖或培养基，回收率分别为102％和108％；该方法批内精密度和批间精密度分别为6．08％和7．01％。结论建立的夹心ELISA方法，其特异性、准确性和精密度均良好，可以特异地检测肺炎球菌1型多糖浓度。

高温处理对转基因作物种子Bt蛋白含量的影响

转基因作物食品安全问题日益受到社会关注,作物种子作为食物的重要来源之一,转基因作物种子的安全性研究更有待加强。分别利用转Bt基因棉花和玉米品种及非转基因品种种子进行高温处理(55-130℃),并用双抗夹心酶免疫检测方法(ELISA)研究其中的外源Bt蛋白的动态变化过程。结果表明,不同作物种子中的Bt蛋白对高温的耐受程度不同,棉花种子中Bt蛋白较玉米种子耐高温能力强;高温处理条件下,种子中的Bt蛋白在10 min内含量显著下降,其后降解缓慢;130℃以上的高温处理条件下,玉米和棉花种子中的外源Bt蛋白均能显著降解。

国产重组抗CD20单克隆抗体在食蟹猴体内的毒代动力学检测方法研究

目的建立一种灵敏度高、特异性好且快速的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,用以检测食蟹猴体内的国产重组抗CD20单克隆抗体(YKY-101)。方法采用双抗夹心的ELISA方法对YKY-101进行定量,以大鼠抗Rituximab为一抗,加入YKY-101后,再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人Ig G,加入底物显色,采用酶标仪读取450 nm(参比波长630 nm)处吸光度值。结果建立并验证了灵敏度高、稳定性良好的检测猴血清中YKY-101的ELISA方法。结论该ELISA方法能够满足YKY-101临床前毒代动力学的要求,可应用于猴血清中YKY-101的浓度检测。

基于二氧化硅-硫堇纳米复合物构建高灵敏癌胚抗原电流型免疫传感器

利用电沉积纳米金(AuNPs)修饰玻碳电极(GCE)表面并通过AuNPs固定癌胚抗原(CEA)的捕获抗体(Ab1),以牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性吸附位点;以γ-(2,3环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPMS)作交联剂,将单分散的SiO_2纳米粒子与电子媒介体硫堇(Thi)结合成SiO_2-Thi纳米复合物,偶联辣根过氧化物酶(HRP)标记的CEA二抗(HRP-Ab2)作为电化学免疫检测信号,构建了具有信号放大效应的电流型免疫传感器并用于CEA的高灵敏检测。在CEA存在下,进行电化学酶联夹心免疫反应。在含有H2O2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,标记在SiO_2-Thi纳米复合物上的HRP能催化H_2O_2氧化电子媒介体Thi,产生增强的还原峰电流,从而提高检测CEA的峰电流响应信号,进而实现对CEA的高灵敏电化学酶联夹心免疫分析。在最优实验条件下,该免疫传感器的差分脉冲伏安(DPV)还原峰电流与CEA质量浓度的对数在0.01~20ng/mL范围内呈良好的线性关系,检出限为3pg/mL(S/N=3)。该传感器对血清样品进行加标回收实验,回收率为97.3%~105.7%,可初步用于临床对CEA的检测。

双抗原夹心酶联免疫试验检测布鲁杆菌病患者方法的评价研究

[目的]在检测不同临床期的布病患者时,评价布鲁氏菌双抗原夹心酶免疫试验(DAgS-ELISA)真实性和诊断效能。[方法]采用病例对照的实验研究方法,布鲁氏菌试管凝集试验(SAT)为标准,比较DAgS-ELISA、快速双抗原夹心ELISA(QDAgS-ELISA)、虎红平板凝集试验(RBPT)、补体结合试验(CFT)以及间接酶联免疫试验(I-ELISA)5种血清学筛检方法。[结果]应用以上5种方法同时检测急性期病例组和对照组血清,DAgS-ELISA的总一致性和约登指数最高,为96.49%和93.44%,其假阴性率最低为2.27%,U检验显示DAgS-ELISA与CFT、Ⅰ-ELISA灵敏度差异有统计学意义(P<0.05),CFT诊断效能最高,为100.00%。对慢性期布病患者和对照组血清进行检测,QDAgS-ELISA、RBPT、Ⅰ-ELISA灵敏度均为100.00%,DAgS-ELISA为93.33%,CFT为40%,U检验显示DAgS-ELISA与RBPT、Ⅰ-ELISA灵敏度间差异无统计学意义(P>0.05),而与CFT间差异有统计学意义(P<0.05)。DAgS-ELISA与Ⅰ-ELISA、CFT间特异度差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]以SAT方法为金标准,DAgS-ELISA方法在检测急性期布病患者时,其敏感度高、特异度强、一致性均较好。

人酸性成纤维细胞生长因子双抗体夹心测定方法

用纯化的人酸性成纤维细胞生长因子（ｈａＦＧＦ）免疫家兔，获得了兔抗ｈａＦＧＦ血清。另从含ｈａＦＧＦ单克隆抗体的小鼠腹水中纯化了ＩｇＧ。用纯化的单抗ＩｇＧ和多抗血清建立了ｈａＦＧＦ的双抗体夹心测定方法，检测水平可达０．２５ｎｇ／ｍｌ。用此方法测定了Ｎ端截断型ｈａＦＧＦ和牛酸性成纤维细胞生长因子（ｂａＦＧＦ），结果显示截断型ｈａＦＧＦ的检测灵敏度较低，ｂａＦＧＦ更低，提示单克隆抗体的抗原识别部位在ｈａＦＧＦ的Ｎ端附近。另外，肝素对ｈａＦＧＦ的检测有明显的影响，说明单抗的抗原识别部位与肝素的结合部位有关．

基于"双抗体夹心法"全自动酶免工作站检测方法的建立

目的 建立"双抗体夹心法"测定抗原含量全自动酶免工作站检测方法,并验证可替代手工操作.方法 根据"双抗体夹心法"检测试剂盒操作规程对全自动酶免工作站进行程序设计,除样品解吸附操作外,样品稀释、多次孵育、多次洗板、加入显示抗体与酶标抗体、加入显色液及酶标仪测定OD值均实现了自动化操作.同时进行了单板和多板自动化检测与人工检测的比对,并对显色底物的稳定性、回收试剂的稳定性及全自动酶免工作站操作精密度和方法精密度进行了考察.结果 单板和多板自动化检测与人工检测的结果比对偏差符合规定;显色液稳定考察结果表明可以提前加入显色液,无需中断程序;回收试剂稳定性满足多次使用,可有效降低检验成本;精密度考察结果表明采用全自动酶免工作站进行60批样品的测定,操作精密度和方法精密度均符合要求.结论 "双抗体夹心法"为半定量方法,步骤繁琐,手工操作影响因素多,并且该方法是目前多种疫苗进行效力检测的主要方法.通过开发全自动酶免工作站检测方法替代手工操作,可有效降低手工操作带来的偏差,提升检验结果的准确度和重现性,并显著提升检验效率.当前新冠疫情仍在全球肆虐,疫苗作为有效遏制疫情蔓延的最有效的武器,需求量的急剧增加对检验效率和检验准确性提出了更高要求.因此,开发全自动酶免工作站替代手工操作在提升检验效率、保障疫苗供应方面具有重要的意义.