火龙果Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶序列的克隆及分析

【目的】克隆Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶(RT)序列并分析其特性,为火龙果遗传变异和进化研究提供新的信息。【方法】根据Ty3-gypsy类反转录转座子RT保守区设计简并引物,从红肉和白肉火龙果及其突变体中扩增出430 bp左右的目标片段,回收、克隆、测序获得RT序列,并进行生物信息学分析;采用RT-PCR检测其转录活性。【结果】共获得82条RT序列,其中有55条序列发生终止密码子突变,5条序列发生移码突变;经RT序列对比,火龙果与水稻、拟南芥有较高的同源性;3条RT序列具有转录活性。【结论】火龙果Ty3-gypsy类反转录转座子RT序列具有高度异质性,部分序列具有转录活性,与其他物种存在反转录转座子的横向传递。

AA染色体组野生种花生Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶序列的多样性

以2份AA染色体组野生种花生为试验材料,扩增分离Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶序列,分析其序列特征、多样性及进化关系。利用根据Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶的保守区设计的简并引物进行PCR扩增,对目的条带进行回收、克隆和测序后,对逆转录酶序列进行生物信息学分析。目的条带大小均约为430 bp,分别从2份AA染色体组野生种花生材料中分离到32、33条逆转录酶序列,对于65条逆转录酶序列,其长度变化范围为397~440 bp,A+T所占比例范围为56.48%~68.14%,(A+T)/(G+C)为1.3~2.13,核苷酸序列间相似性范围为62.6%~97.9%;65条逆转录酶序列被划分为9个家族,其中家族Ⅰ为主要成分;翻译成氨基酸后,序列间相似性范围为12.4%~98.6%,相比核苷酸序列,氨基酸序列表现出更高的异质性;65条逆转录酶序列中有26条发生了无义突变,2份野生种花生材料的无义突变发生率相当;序列间保守基序大体一致,但也发生了一定的变异,呈现出一定的异质性;9个家族所选代表序列的蛋白质结构总体类似,但也在螺旋结构数、折叠结构数、转角数、氢键数、α-螺旋数、β-折叠数上存在差别;系统进化树显示,所有逆转录酶序列被分为13类,A类和B类中包含大部分逆转录酶序列,E类中的5条AA染色体组野生种花生与其他物种植物的逆转录酶序列具有较高相似性,表明这些序列在进化过程中有可能发生了横向传递;通过比对花生EST数据库,发现3条来自Archis duranensis(PI262133)和2条来自A.duranensis(PI219823)的Ty3-gypsy类逆转座子具有转录活性,本研究为下一步分离Ty3-gypsy类逆转座子全长序列、研究其转录转座活性和功能提供序列基础,也为基于Ty3-gypsy类逆转座子的花生属分子标记开发奠定基础。

果蔗Ty3-gypsy类反转录转座子RT基因的多样性分析

【目的】分析Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶基因(RT)序列特征、多样性、系统进化关系及转录活性,为深入研究果蔗Ty3-gypsy类反转录转座子全长序列、转录转座活性及生物学功能提供理论参考。【方法】以果蔗品种拔地拉为试材,根据Ty3-gypsy类反转录转座子RT基因保守区设计简并引物对,利用其进行PCR扩增,将目的条带回收纯化后连接至pMD18-T载体,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆进行测序。依据测序结果对RT基因序列进行生物信息学分析。【结果】从果蔗拔地拉中扩增获得51条序列(SoRT4-1~SoRT4-51),去除重复序列和非RT基因序列后共获得44条RT基因序列,长度为423~433 bp,AT含量为56.84%~64.97%,AT∶GC比值为1.32~1.85,核苷酸序列间相似性为44.4%~99.3%,其编码的氨基酸序列间相似性为10.8%~100.0%,说明氨基酸序列比核苷酸序列表现出更高异质性。44条RT基因序列被划分为4个家族,其中Ⅰ和Ⅲ为主要家族。44条RT基因编码的氨基酸序列中有20条发生了无义突变,说明其突变率较高。44条RT基因编码蛋白序列存在5种保守基序,其中,有29条序列同时包含Motif 1~Motif 4,其余15条序列的保守基序变异较大,说明保守基序存在一定异质性。4个家族代表性序列编码蛋白的三级结构在氢键和转角的数量方面差异较大;系统发育进化树分析结果显示,44条RT基因序列被分为七大类,Ⅰ类和Ⅱ类中的果蔗RT基因序列分别占序列总数的40.91%和27.27%,Ⅱ类和Ⅵ类中的部分果蔗RT基因序列与拟南芥的BAB40828.1、粳稻的BAB40824.1、菠菜的BAB40833.1和大豆的BAB40834.1亲缘关系较近,推测这些物种在进化过程中发生了Ty3-gypsy类反转录转座子的横向传递。初步发现1条Ty3-gypsy类反转录转座子(SoRT4-40)具有转录活性。【结论】获得44条果蔗Ty3-gypsy类反转录转座子RT基因序列,其中仅有1条序列具有转录活性,这些RT基因序列可用于开发基于Ty3-gypsy类反转录转座子的甘蔗分子标记。

辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列的克隆及分析

【目的】从辣椒基因组中克隆Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列,分析其家族特性及进化关系。【方法】根据Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶保守区域设计简并引物,通过PCR扩增、回收、克隆、测序得到的目的基因序列。【结果】克隆从辣椒基因组14条逆转录转座子逆转录酶序列,序列大小均为340 bp左右。生物信息学分析表明,序列长度变化范围为310~345 bp,同源性范围为60.2%~99.1%。这些核苷酸序列具有较高的异质性,主要表现为终止密码子突变。聚类分析可将所得序列分为5大类,基于逆转录酶序列进行的不同物种进化树分析显示,第Ⅳ、Ⅴ类序列与荸荠、潘那利番茄等组成一大类,可能是逆转录转座子横向传递的结果。【结论】辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列具有普遍性、异质性等特点,与荸荠、潘那利番茄等物种的同类型逆转座子可能有相同的起源。

甘蔗Ty3-gypsy类逆转座子RT基因的克隆及分析

【目的】从甘蔗基因组中分离Ty3-gypsy类逆转座子的RT基因序列,分析序列的特点、差异及系统进化关系,为研究其转录活性和调控功能奠定基础。【方法】根据Ty3-gypsy类逆转座子RT基因序列的保守区设计简并引物,对甘蔗品种新台糖22的基因组DNA进行PCR扩增,目的条带经回收、克隆和测序后,对所获得序列进行生物信息学分析。【结果】目的条带大小约430 bp,成功分离到36条RT基因序列,只有1条序列的长度为430 bp,其余序列的长度均为432 bp,AT所占比为56.71%~64.81%,AT与GC比值为1.31~1.84;核苷酸序列间相似性为46.2%~99.3%。聚类分析后,36条RT基因序列被划分为5个家族,家族Ⅰ和家族Ⅳ是包含序列最多的家族。翻译后,有6条序列发生了无义突变;氨基酸序列间相似性为10.1%~100%,呈现高度异质性;36条RT基因序列中的34条序列的保守基序完全一致,呈现高度保守性。各家族中代表序列的蛋白质三级结构整体构型基本类似,但在氢键数和转角数上存在着较大差别,呈现一定异质性和多态性。系统进化树显示,所有RT基因序列被分为7类,Ⅰ类中的18条甘蔗RT基因序列与拟南芥的BAB40828.1具有较高相似性,Ⅶ类中的SoRT3-26与大豆的BAB40834.1、菠菜的BAB40833.1和粳稻的BAB40824.1的亲缘关系最近,暗示在进化过程中甘蔗与这些物种植物之间可能发生了Ty3-gypsy类逆转座子的横向传递;通过比对甘蔗EST数据库,发现了10条具有转录活性的甘蔗品种新台糖22的Ty3-gypsy类逆转座子。【结论】获得甘蔗Ty3-gypsy类逆转座子RT基因序列及其具有转录活性序列,为下一步分离Ty3-gypsy类逆转座子全长序列及研究Ty3-gypsy类逆转座子转录转座活性和功能提供序列基础,也为开发甘蔗LTR逆转座子的分子标记奠定基础。

四倍体野生种花生Ty3-gypsy类反转录转座子RT基因的分离及序列分析

本研究从四倍体野生种花生中分离了Ty3-gypsy类反转录转座子的反转录酶(RT)基因序列,分析了其序列特点和差异,为研究其转录活性和功能奠定基础。根据Ty3-gypsy类反转录转座子RT基因的保守区设计简并引物,PCR扩增四倍体野生种花生(Arachis monticola)(PI468199)的DNA,目的条带经回收、克隆和测序后,进行生物信息学分析。结果显示,目的条带大小约为430 bp,共有29条AmRT2-X基因序列被分离出,这些序列长度变化范围为397~433 bp,AT所占比例范围为55.66%~65.97%,核苷酸序列间相似性在45.1%~97.2%之间,存在较高异质性;29条AmRT2-X基因序列被聚类划分为8个家族,家族A是包含序列最多的家族;翻译成氨基酸后,有10条AmRT2-X基因序列发生了无义突变;氨基酸序列间相似性在22.3%~98.6%之间,呈现高度异质性;绝大部分AmRT2-X基因序列的保守基序一致;系统进化树显示,所有RT基因序列被分为6类,其中,Ⅰ类包含20条AmRT2-X基因序列,Ⅱ类中的4条Am RT2-X基因序列与来自拟南芥、多花黑麦草、火龙果、牡丹、果梅、枣、山桑、白皮松等物种的序列之间亲缘关系较近;通过比对花生EST数据库,发现2条具有转录活性的四倍体野生种花生Ty3-gypsy类反转录转座子。本研究为Ty3-gypsy类反转录转座子全长序列的分离及其功能的研究提供一定基础。

牡丹Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶序列的克隆及分析

根据 Ty3-gypsy 反转录转座子反转录酶的保守序列设计简并引物,从中原牡丹(Paeonia suffruticosa Andrews)品种‘洛阳红’和野生种卵叶牡丹(Paeonia qiui Y. L. Pei et D. Y. Hong)中扩增出430 bp 左右的目标片段。目的条带经回收、克隆、测序及相关生物信息学软件进行序列分析后,获得了13 条来自牡丹的 Ty3-gypsy 反转录转座子反转录酶序列。这些核苷酸序列具有较高的异质性,主要表现为缺失突变,序列长度变化范围为 412 ～ 446 bp,同源性范围为 71.5% ～ 94.8%。翻译成氨基酸后,有 12 条序列出现 1 ～ 9 个不同程度的终止密码子突变,3 条序列出现移框突变。其核苷酸序列经过系统聚类后可分为 6 个家族。将其氨基酸序列与已登录的不同物种 Ty3-gypsy 反转录转座子反转录酶的氨基酸序列进行聚类分析,结果表明与其他植物具有较高的同源性,表明它们间可能存在着 Ty3-gypsy 反转录转座子的横向传递。

兴安落叶松Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶的多样性分析

为分析兴安落叶松（Larix gmelinii Rupr.）逆转座子的特点及其多样性与系统进化关系,本研究利用兼并-PCR技术克隆了27条Ty3-gypsy型逆转座子逆转录酶基因序列。这些核苷酸序列长度变化范围为376~417 bp,同源性范围为55.9%~91.4%,具有较高的异质性。系统聚类分析发现,这27条核苷酸序列被分为7个组。翻译成氨基酸后,其中有8条序列出现了终止密码子突变,有2条序列出现了移框突变。将其氨基酸序列与已登录的其它物种的Ty3-gypsy型逆转座子逆转录酶进行聚类分析发现,兴安落叶松的Ty3-gypsy型逆转座子与枣、黄瓜、可可树等同类型的逆转座子逆转录酶有较近的亲缘关系。以上研究表明兴安落叶松的逆转座子具有高度的多样性,可为分析兴安落叶松基因组构成及遗传多样性提供实验依据。

栽培种花生Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶基因序列的分离与分析

植物长末端重复(long terminal repeat,LTR)逆转座子具有普遍性、高拷贝、高异质性和插入多态性,适合开发成分子标记。本研究从栽培种花生(Arachis hypogaea)基因组中获得Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶基因序列,分析其特点和差异,为基于LTR逆转座子的分子标记开发奠定基础。利用根据Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶基因保守区设计的简并引物对栽培种花生‘桂花1026’品种的基因组DNA进行PCR扩增,目的条带经回收、克隆和测序后,对获得序列进行生物信息学分析。克隆到27条逆转录酶基因序列,序列长度皆为432 bp,AT所占比例为55.32%~66.90%,AT与GC比值为1.24~2.02,核苷酸序列间相似性为44.90%~98.80%,呈现较高异质性;聚类分析后,27条基因序列分为3个家族,家族Ⅰ是主要成分;27条编码蛋白序列的基因中有10条发生了无义突变;基因编码蛋白序列间相似性为34.50%~97.90%,呈现高度异质性;除AhRT2-4外,各基因编码蛋白序列间保守基序完全一致;对栽培种花生和其他物种植物的Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶序列构建系统进化树,进化树显示所有序列被分为6类,其中,Ⅰ类包含19条其他植物物种和1条栽培种花生的序列,Ⅱ类包含8条其他物种和7条栽培种花生的序列,表明栽培种花生逆转录酶序列具有较高的保守性,栽培种花生逆转录酶基因编码蛋白序列与绿豆(Vigna radiata)、枣(Ziziphus jujuba)、黄瓜(Cucumis sativus)、油棕(Elaeis guineensis)、火龙果(Hylocereus undatus)等植物的逆转录酶序列亲缘关系较近,表明不同植物的Ty3-gypsy逆转座子之间可能存在着水平基因转移;通过比对花生EST数据库,发现了4条具有转录活性的栽培种花生Ty3-gypsy类逆转座子。本研究所获得的逆转录酶基因序列可为栽培种花生Ty3-gypsy逆转座子的分子标记开发利用及分子育种奠定一定基础。

水稻gypsy类逆转座子对不同胁迫条件的响应

LTR类逆转座子是水稻基因组中数量最多、分布最广的转座元件,其中Ty3–gypsy类所占比例较大。根据Ty3–gypsy类逆转座子逆转录酶的保守区域,采用简并引物,通过RT–PCR,对5种胁迫处理(稻瘟菌、水杨酸、2,4–D、高盐及组织培养)后的云南地方水稻品种月亮谷的cDNA进行扩增,并测序获得了一批转录片段,分析不同胁迫条件诱导激活的Ty3–gypsy类逆转座子的特点。结果表明:5种胁迫处理都能诱导月亮谷中Ty3 gypsy类逆转座子的表达;对不同胁迫响应的逆转座子序列大部分同源性较高,且呈交叉分布,仅有少部分具有胁迫响应的特异性,说明很多Ty3–gypsy类逆转座子能对不同胁迫进行响应。

枇杷LTR类反转录转座子RT序列的克隆及分析

【目的】揭示枇杷LTR类反转录转子座RT序列在枇杷基因组中的异质性,为枇杷转座子进化和多样性研究提供依据。【方法】以普通枇杷野生种质的叶片为材料,通过简并引物从枇杷基因组中扩增得到Ty1-copia和Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶序列,并对其序列变化特点进行生物信息学分析。【结果】最终获得38条Ty1-copia类RT序列和24条Ty3-gypsy类反转录转座子RT序列。其中Ty1-copia类反转录转座子RT序列的长度为257~266 bp,序列相似率为22.6%~97.6%,聚类结果显示,其核苷酸序列存在Maxium、TAR和Angela 3个支系。将核酸序列翻译为氨基酸后,有4条序列发生移码突变,12条序列发生终止密码子突变。Ty3-gypsy类反转录转座子RT序列的长度为429~438 bp,序列相似率为48.1%~99.3%,聚类结果显示,其核苷酸序列存在Tat和Reina2个支系。将核酸序列翻译为氨基酸后,有3条序列发生移码突变,7条序列发生终止密码子突变。对序列同义突变率与非同义突变率的分析结果显示,枇杷Ty1-copia和Ty3-gypsy类RT序列dN/dS均小于1。与其他植物反转录转座RT氨基酸序列进行比对,发现枇杷、梅、苹果、李可能具有共同起源。【结论】所获得的枇杷反转录转座子反转录酶氨基酸序列具有高度异质性,序列在进化过程中受到纯化选择的作用。对不同物种反转录转座RT氨基酸序列进行比对,结果表明,反转录转座子在枇杷和其他物种间可能存在横向传递。

梨反转录转座子逆转录酶序列预测及其进化和转录分析

基于生物信息学方法对‘酥梨’基因组中不同类型的逆转录酶进行预测,共获得345条copia类和99条gypsy类逆转录酶。通过系统聚类,copia类逆转录酶可分为Ivana、Ale、TAR、Angela、Maximus和Bianca等6类;gypsy类逆转录酶可分为Athila、Tat、CRM、Reina和Tekay等5类。序列比对结果显示梨中逆转录酶具有较高的异质性,copia类逆转录酶序列分歧度为0.44,gypsy类为0.38。挑选出8类逆转录酶设计引物,并对梨属其它植物进行PCR扩增,结果显示这8类逆转录酶广泛存在于梨属植物中。在砂梨品种‘圆黄’的叶片、种子和果实中均发现该8类逆转录酶存在一定的转录水平,这是首次发现在梨属植物正常生长组织中逆转录酶发生转录。

中国樱桃LTR类反转录转座子反转录酶序列的克隆和分析

利用同源序列法根据Ty1-copia和Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶保守区设计简并引物,从中国樱桃(Prunus pseudocerasus Lindl.)中分别扩增出约260和430 bp的目标片段,并进行克隆、测序、序列分析及转录活性检测。共获得44条Ty1-copia类反转录酶序列,13条Ty3-gypsy类反转录酶序列,序列间显示高度异质性,部分序列存在缺失、终止密码子及移码突变。系统发育树显示Ty1-copia可以分为TAR、Ale两类,Ty3-gypsy可以分为Tat、Reina、Tekay等3类。Ty1-copia和Ty3-gypsy类反转录酶dN/dS值均小于1,并且Ty3-gypsy高于Ty1-copia。13条Ty1-copia以及7条Ty3-gypsy反转录酶序列在樱桃正常生长条件下均有转录活性,但不受8种非生物胁迫的诱导。PpRT7在高温(42℃)胁迫24 h时转录活性升高,并且具有组织特异性。

桂花LTR类反转录转座子RT序列的克隆及分析

克隆获得桂花Ty1-copia和Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶(reverse transcriptase,RT)序列,并对其序列变化特点进行分析,以期为桂花基因组进化和多样性研究提供依据。根据Ty1-copia和Ty3-gypsy类反转录转座子RT保守区设计简并引物,以桂花叶片基因组DNA为模板,通过PCR扩增,分别得到260和430 bp左右的目标条带,经回收、克隆、测序及相关生物信息学软件进行序列分析后,获得49条Ty1-copia类反转录转座子RT序列和20条Ty3-gypsy类反转录转座子RT序列。通过核苷酸聚类,Ty1-copia类反转录转座子RT序列分为4类。这些序列长度为255~271 bp,序列相似性为32.0%~96.9%。翻译成氨基酸后,有2条序列出现移码突变,16条序列出现终止密码子突变。Ty3-gypsy类反转录转座子RT序列也分为4类。序列长度为408~449 bp,相似性为54.7%~98.8%。有8条序列发生移码突变,10条序列发生终止密码子突变。经反转录转座子RT氨基酸序列比对,桂花与梅花、李、枣等可能有共同的起源。桂花Ty1-copia和Ty3-gypsy类反转录转座子RT序列具有高度异质性;系统进化树分析表明,桂花与不同物种间可能存在反转录转座子的横向传递。