口蹄疫病毒(FMDV)O型与Asia1型联合RT-PCR检测方法的建立

[目的]建立针对O型与Asial型FMDV的二联RT-PCR检测方法。[方法]在大量比较国内外口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株序列的基础上自行设计了检测O型与Asia1型FMDV二联PCR引物。[结果]本试验确定了单项RT-PCR反应条件范围,在此基础上建立、优化了二联RT-PCR反应体系和反应条件,建立了有效、特异、敏感的检测O型FMDV与Asia1型FMDV的二联RT-PCR方法。[结论]本试验为口蹄疫的诊断、防制、流行病学调查及疫苗的使用奠定了基础。

云南省新平县家畜O型口蹄疫血清学监测

为了解新平县猪牛羊O型口蹄疫的免疫抗体水平,评估疫苗免疫效果,2018—2022年连续5年在12个乡镇(街道),分别采集猪、牛、羊血清样品2289、2020、2491份,采用ELISA方法进行O型口蹄疫病毒(FMDV)血清抗体检测,汇总检测结果进行不同畜种、不同饲养规模、不同季节的统计分析。结果显示:牛、羊、猪O型FMDV平均抗体合格率分别为86.53%(1748/2020)、81.65%(2034/2491)、68.20%(1561/2289),不同畜种间抗体阳性率差异有统计学意义(P<0.001);规模场O型FMDV平均抗体合格率为80.93%(3026/3739),散养户为75.69%(2317/3061),差异有统计学意义(P<0.001);春季、秋季的牛抗体阳性率分别为86.15%、86.89%,羊抗体阳性率分别为82.14%、81.19%,猪抗体阳性率分别为67.08%、69.42%,春季、秋季间同一畜种的抗体阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明:2018年以来,新平县牛羊O型口蹄疫免疫效果较好,但猪免疫效果较差,尤其是散养户,存在疫情发生风险。结果提示,需加强生猪养殖户尤其是散养户的O型口蹄疫免疫和监测工作,以降低猪群的感染风险。本研究为当地家畜口蹄疫防控政策的制定提供了数据支撑。

CpG DNA重组质粒对猪O型口蹄疫病毒抗原的免疫佐剂效应

作者应用含CpG基序序列的重组质粒（即CpG DNA）作为免疫佐剂,评价其对猪O型口蹄疫病毒抗原疫苗的免疫增强效果。结果表明：CpG DNA重组质粒与猪口蹄疫灭活病毒抗原疫苗配伍免疫小鼠,CpG DNA重组质粒对小鼠具有较强的免疫佐剂效应,能促进口蹄疫病毒抗原诱导产生较高水平的特异性抗体,其抗体滴度是空载体疫苗对照的2倍。CpG DNA重组质粒与商品化猪口蹄疫灭活疫苗配伍免疫试验猪,其增强抗原诱导的特异性抗体滴度最高可达标准疫苗的4倍以上,也显著高于空载体疫苗对照 与病毒纯化抗原配伍免疫动物,攻毒后其免疫保护效力的PD50高达13.00,远高于标准疫苗对照（PD504.69）。在CpG DNA重组质粒剂量选择试验中,含低剂量的CpG DNA疫苗（50、200μg.头份-1）都比高剂量组（500μg.头份-1）诱导的抗体滴度高,其中50和200μg.头份-1的CpG DNA剂量,在接种后14~32 d诱导的抗体滴度高达1∶1500,是标准疫苗的4~5倍,而500μg.头份-1剂量诱导的抗体仅是标准疫苗的2倍,说明CpG DNA重组质粒在低剂量时即可发挥强烈的佐剂效应。研究表明CpG DNA对猪O型口蹄疫病毒抗原疫苗有较强的免疫佐剂效应,且使用剂量低,应用前景广阔。

O型口蹄疫泛亚毒株单克隆抗体的制备及抗原表位差异分析

用纯化的O型口蹄疫泛亚毒株免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经3次克隆和间接ELISA筛选,获得了ⅢA11、ⅢC3和ⅢF10 3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株.通过间接ELISA测定,单抗效价为:细胞培养上清1:160～1:640,腹水为1:5×104～1:4×105;经ELISA法测定,3株单克隆抗体均与泛亚株VP1蛋白反应,而不与A型口蹄疫病毒VP1蛋白反应;单抗的亚类鉴定结果表明,ⅢA11和ⅢF10分泌的抗体为IgG1亚类,ⅢC3分泌的抗体为IgG2b亚类.单克隆抗体抗原识别位点分析结果表明,ⅢA11与另外2种单克隆抗体的识别位点不同,而ⅢC3和ⅢF10的识别位点相近.

O型口蹄疫病毒VP1嵌合基因的构建及原核表达

首先合成我国O型口蹄疫病毒2个疫苗毒株VP 1基因的3个抗原表位,与另外扩增的流行毒株VP 1基因末端273 bp片段相连,构建出O型VP 1嵌合基因片段(VP 1O)。然后,将VP 1O基因连接到原核表达载体pET 28a上,构建了重组表达质粒pET 28a-VP 1O,转化大肠杆菌BL 21(DE 3)进行诱导表达。SDS-PAGE电泳表明,VP 1O基因在大肠杆菌中获得表达。W estern b lotting检测证实表达的VP 1O蛋白具有良好的生物学活性。对表达蛋白通过包涵体洗涤的方法进行初步纯化,获得了较高纯度的VP 1O蛋白。

抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体相对亲和力的测定

目的:对3株O型口蹄疫病毒单克隆抗体(4A9、4C3、9F12)的相对亲和力进行测定。方法:用纯化的O型口蹄疫病毒作为包被抗原建立一种检测方法,将3株单克隆抗体(4A9、4C3、9F12)制备腹水并纯化,并用建立的检测方法测定3株单克隆抗体(4A9、4C3、9F12)的相对亲和力。结果:检测方法中抗原、酶标抗体的最佳稀释度分别为1∶800和1∶10000,单抗的相对亲和力分别为:4A9约在5.242μg/ml(1∶600),4C3约在0.763μg/ml(1∶5000),9F12约在0.127μg/ml(1∶40000),即9F12>4C3>4A9。结论:用建立的ELISA方法测定了3株O型口蹄疫病毒单克隆抗体(4A9、4C3、9F12)的相对亲和力,将为进一步研究口蹄疫病毒而选取合适的单抗提供理论依据。

口蹄疫病毒O型Cathay毒株的分离鉴定

[目的]研究FMD疑似组织病料,为口蹄疫相关研究工作提供试验参考。[方法]应用细胞培养、电镜观察、反向间接血凝试验、RT-PCR及测序技术对FMD疑似组织病料进行分离鉴定,确定其血清型及基因型。[结果]结果显示,分离鉴定的FMD疑似组织病料为O型Cathay口蹄疫病毒株。[结论]为口蹄疫的诊断、防治、流行病学调查及疫苗的研究使用奠定了基础。

融合表达牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒P12A3C基因的DNA疫苗的构建及其免疫应答

用小鼠模型评价融合表达牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒P12A3C基因的DNA疫苗和不同免疫策略的免疫应答。用PCR方法扩增牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒P12A3C基因,分别克隆到pMD18-T载体并测序验证正确后将其克隆到质粒pcDNA的相应位点获得质粒pcDNA-VP22-P12A3C。然后将BALB/c小鼠分成7组进行免疫。结果表明,DNA疫苗pcDNA-VP22-P12A3C诱导的细胞免疫水平超过了灭活疫苗,DNA疫苗与灭活疫苗联合免疫组体液免疫水平接近灭活疫苗组而细胞免疫水平远高于灭活疫苗组,为进一步研究VP22和P12A3C融合表达的基因工程疫苗奠定了基础。

口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立

【目的】建立一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、AsiaI型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA)。【方法】采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、AsiaI型口蹄疫抗体。将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72and AsiaⅠ/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带。经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒。【结果】本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104LD50(1﹕128倍稀释乳鼠毒)的病毒量。同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原,如猪水疱病抗原(SVD)、水泡性口炎(VS)、水泡性疹(VES)等病毒时无交叉反应;试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验,O、A、AsiaⅠ型和阴性样本的符合率分别为92.45%、91.66%、92.75%、100%定型准确率94.58%。试剂盒在4℃下可保存6个月。【结论】本试验研发的口蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值。

采用泊洛沙姆为佐剂的O型口蹄疫多肽疫苗对大鼠脾细胞的增值作用

为研究泊洛沙姆作为佐剂的O型口蹄疫多肽疫苗对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测不同浓度的泊洛沙姆407、FMDV-O型泊洛沙姆佐剂多肽疫苗(多肽浓度50μg/m L)、FMDV O型多肽抗原液(7.06 mg/m L,用PBS稀释至50μg/m L)及FMDV O型油乳佐剂多肽疫苗(多肽浓度50μg/m L)对伴刀豆球蛋白A(Concanavalin A,Con A)处理淋巴细胞的增殖率。结果表明,与空白对照组相比较,泊洛沙姆各浓度对脾细胞均有增殖作用,多肽疫苗在高浓度的时候对细胞有抑制作用,随着作用浓度的降低,又进而转为细胞增殖作用。

FMDV抗原表位与hsp_(70)的融合表达及表达产物对小鼠的免疫应答

将人工合成的O型口蹄疫病毒主要表位基因与结核杆菌热休克蛋白70(HSP70)基因克隆入酵母表达载体pPICZαA中,以电穿孔法转化酵母菌X-33,用Zeocin平板筛选重组子,PCR鉴定后甲醇诱导表达。SDS-PAGE显示,其相对分子质量为89 000,表达量约为190 mg.L-1;免疫印迹分析证实表达产物具有免疫反应性。融合蛋白以皮下接种的方式对8只小鼠进行3次免疫,然后通过ELISA和MTT分别检测抗体水平和淋巴细胞增殖反应。结果表明,融合蛋白既能诱导细胞免疫应答,又能诱导体液免疫应答,其产生的抗体水平接近于常规灭活疫苗。MTT试验结果显示,融合蛋白的A570为0.381±0.072,灭活疫苗的A570为0.340±0.050,表明融合蛋白的细胞免疫应答水平高于后者。提示,hsp70作为分子佐剂在口蹄疫基因工程疫苗研究中具有很好的应用前景。

ECMS对O-Asia Ⅰ型FMD疫苗免疫功能增强的初探

目的证实ECMS增强O-Asia I型FMDV疫苗免疫功能的有效性,选择ECMS使用的有效浓度及诱导抗体的维持时间。方法本文用ELISA法测定了免疫后3、6、14周O型FMDV VP1及AsiaI型FMDV抗体的滴度。结果与结论与疫苗组和阳性组对照,100μgECMS诱导O-Asia I型FMDV疫苗产生两种抗体的效价较高,维持时间较长。相对来讲,ECMS诱导O型FMDV疫苗的抗体含量较高,但下降较快;诱导Asia I型FMDV疫苗的抗体较低,但下降非常缓慢。100μgECMS的效果优于公认的皂树皂甙(QA)佐剂。

乌鲁木齐地区牛口蹄疫O型Asia-Ⅰ型双价灭活疫苗免疫效果的检测与分析

[目的]研究乌鲁木齐地区牛口蹄疫O型Asia-Ι型双价灭活疫苗的免疫效果。[方法]应用液相阻断ELISA法检测492份口蹄疫O型Asia-Ι型双价灭活疫苗的免疫效果。[结果]免疫牛群对牛口蹄疫O型的平均免疫合格率为97.6%,对Asia-Ι型的平均免疫合格率为97.7%。[结论]牛口蹄疫O型Asia-Ι型双价灭活疫苗可以使免疫牛产生有效的免疫保护。

O型口蹄疫病毒衣壳酸敏感性位点的筛选

为筛选与O型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳酸敏感性相关的位点,本研究以牛源O型FMDV ON株为研究对象开展耐酸性毒株筛选工作。通过给予pH 6.0酸性环境连续诱变,筛选获得6株耐酸性毒株。将诱变病毒与亲本病毒衣壳蛋白编码区P1区序列比对后发现7个核苷酸突变,即共同存在于6株耐酸毒株P1区的错义突变A1334G(Y445C)、A1643G(Q548R)、A1822G/A1823C(N608A)及同义突变G1371A,另有仅存在于耐酸毒株m2P1区的错义突变C1849T(P617S)和仅存在于耐酸毒株m1P1区的同义突变G468T。本研究为O型FMDV酸敏感性分子机制的揭示及病毒衣壳酸稳定性的提高奠定了基础。

口蹄疫病毒O型抗体液相阻断ELISA试验的测量不确定度评估

为探索一种较为合理的兽医实验室ELISA试验的测量不确定度评估模式,应用液相阻断ELISA试验方法,对口蹄疫O型抗体进行检测,依据《测量不确定度评定与表示》(JJF1059.1—2012),分析试验的不确定来源并评定各分量的标准不确定度、合成标准不确定度和扩展不确定度。结果显示:最终cutoff临界值与样品判定浓度的OD_(450 mm)值的比值为1.390,U=0.221(k=2);测量不确定度的加入提升了测量结果的可信度,并有效降低了假阳性、假阴性出现的风险;分析不确定度各分量对测量结果的相对贡献,可以找出影响检测质量的主要因素,从而有利于实验室的质量控制和检测质量的提高。

仔猪心肌原代细胞培养及其对口蹄疫病毒敏感性研究

目的旨在建立仔猪原代心肌细胞的培养方法,探索O型口蹄疫病毒对易感动物心肌原代细胞的敏感性,为研究O型口蹄疫感染引发幼畜心肌炎致病机理提供细胞模型。方法利用混合消化酶(2g/L胰蛋白酶(trypsin)和1g/LⅡ型胶原酶(collagenase)1∶1混合)消化法培养原代心肌细胞;相差显微镜观察心肌细胞生长和波动情况;胎盘蓝对细胞染色,鉴定细胞成活率。将生长良好的原代心肌细胞接种口蹄疫O型乳鼠毒观察其敏感性,同时将该毒接种BHK21细胞做平行对比。结果仔猪原代细胞成活率为95.6%;成活细胞形态完整,部分细胞自行蠕动,当生长成片后可见呈岛屿状搏动。仔猪原代心肌细胞对O型口蹄疫病毒敏感。与BHK21细胞相比,结果无明显差异。结论本试验成功培养了仔猪心肌原代细胞,并且培养的原代细胞对O型口蹄疫病毒敏感。

口蹄疫乳鼠毒在蚯蚓和苍蝇中实验带毒的研究

O型口蹄疫(FMD)乳鼠毒注射到蚯蚓(Pheretima sp.)体内后的第8天仍可检测到口蹄疫病毒(FMDV),但第14天以后则未查出。将此病毒洒在蚯蚓生活的土壤中,检测蚯蚓体内FMDV的结果亦同。本试验还间接地表明,FMDV不能在蚯蚓体内复制、增殖,蚯蚓只起携带FMDV的作用。蚯蚓属于低等动物,免疫系统尚未健全,但对非已物质有一定的免疫应答。蚯蚓与FMDV接触后,用间接血凝测得其体腔液中具有“抗体”反应。FMDV与舍蝇属(Muscasp.)和金蝇属(Chrysomyia sp.)的苍蝇接触24小时后,对其带毒检测结果表明:苍蝇只能短时在体表携带FMDV,且苍蝇体表携带FMDV的量很少。故认为在FMDV传播中苍蝇只起短时机械扩散作用。

FMD、HC和PRRS疫苗不同组合接种免疫效果的比较

为了研究猪O型口蹄疫(FMD)、猪瘟(HC)、高致病性猪蓝耳病(PRRS)疫苗不同组合的免疫效果,在黔东南州3个养殖场各选择35日龄仔猪120头,每个场分成6个实验组,每组20头,在免疫后的21、28、35、42、49、56、63 d采血检测抗体,FMD、HC用正向间接血凝试验检测,PRRS用间接ELISA检测。结果表明:同一场内不同试验组的FMD、HC、PRRS抗体变化规律相似,组间差异不显著(P>0.05);疫苗单独免疫与两两组合同时分点注射,免疫效果一致。