表达VASH1基因的人脑胶质瘤U-87MG细胞对化疗药物敏感性的变化

目的探讨表达人血管生成抑制因子1(VASH1)的人脑胶质瘤U-87MG细胞对化疗药物的敏感性变化。方法构建针对VASH1的慢病毒载体p GCL-GFP-VASH1,经测序鉴定后转染293T细胞,筛选出适合浓度的慢病毒转染人脑胶质瘤U-87MG细胞,荧光显微镜下检测转染效率;通过RT-PCR和Western blot分析U-87MG细胞VASH1 m RNA和蛋白表达水平;用CCK-8法检测U-87MG细胞在化疗药物顺铂和替莫唑胺作用下的存活率。流式细胞仪检测U-87MG细胞凋亡。结果成功构建p GCL-GFP-VASH1慢病毒载体,并成功转染U-87MG细胞,转染率达70%以上;RT-PCR和Western blot结果证实转染VASH1慢病毒载体的U-87MG细胞表达VASH1 m RNA和蛋白。在顺铂或替莫唑胺作用下,表达VASH1的U-87MG细胞存活率均较未表达VASH1的U-87MG细胞明显降低(P<0.01),而且U-87MG细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论 VASH1慢病毒载体转染U-87MG细胞可使其稳定表达VASH1,并提高人脑胶质瘤U-87MG细胞对化疗药物敏感性、增加细胞凋亡率。

泛素连接酶LRSAM1对人神经胶质母细胞瘤细胞生物学行为的影响及其可能机制

目的探讨泛素连接酶LRSAM1在CD166降解中的作用及其对人神经胶质母细胞瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法人神经胶质母细胞瘤U-87 MG细胞,采用免疫共沉淀法检测LRSAM1与CD166是否存在结合;将对数生长期U-87 MG细胞分为pcDNA3.1-LRSAM1组、pcDNA3.1-NC组和空白对照组,pcDNA3.1-LRSAM1组和pcDNA3.1-NC组细胞分别转染pcDNA3.1-LRSAM1质粒载体和pcDNA3.1空质粒载体,空白对照组细胞正常培养,采用实时荧光定量PCR法检测3组细胞LRSAM1 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测LRSAM1蛋白相对表达量,采用免疫荧光染色法检测LRSAM1与CD166表达情况,采用细胞克隆形成实验检测细胞集落形成数目,采用Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡率,采用细胞划痕试验检测细胞划痕愈合率,采用Transwell小室实验检测侵袭细胞数。结果 U-87 MG细胞中LRSAM1与CD166存在结合。pcDNA3.1-LRSAM1组细胞LRSAM1 mRNA和蛋白相对表达量(3.26±0.28、0.72±0.06)均高于空白对照组(1.00±0.03、0.18±0.01)和pcDNA3.1-NC组(0.99±0.02、0.19±0.02)(P<0.05),转染成功。U-87 MG细胞LRSAM1与CD166共定位,pcDNA3.1-LRSAM1组LRSAM1荧光染色强度增加,CD166荧光染色强度减弱;转染后pcDNA3.1-LRSAM1组细胞集落形成数目[(69.21±7.54)个]、侵袭细胞数[(33.71±4.17)个]均少于空白对照组[(142.38±14.61)、(68.87±9.42)个]和pcDNA3.1-NC组[(152.40±15.92)、(75.54±9.06)个](P<0.05),细胞凋亡率[(17.41±2.03)%]高于空白对照组[(8.07±0.79)%]和pcDNA3.1-NC组[(8.45±0.88)%](P<0.05),细胞划痕愈合率[(30.16±4.10)%]低于空白对照组[(58.22±5.82)%]和pcDNA3.1-NC组[(62.09±7.13)%](P<0.05);空白对照组与pcDNA3.1-NC组各指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论过表达LRSAM1可抑制人神经胶质母细胞瘤U-87 MG细胞增殖、侵袭与迁移,促进细胞凋亡,其机制可能与LRSAM1结合CD166有关。