ERK抑制剂U0126通过下调cyclin D1与survivin蛋白表达抑制乳腺癌细胞增殖

目的 研究ERK通路抑制剂U0126对乳腺癌细胞增殖的抑制作用,并探讨其调控机制。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB231,将细胞分组干预,MTT法检测各组细胞增殖情况;流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞凋亡;Western blot检测细胞中p-ERK/ERK、cyclin D1、survivin及cleaved caspase-3蛋白表达。结果 MTT结果显示,U0126干预24、48 h后,MCF-7、MDA-MB231细胞抑制率明显增加(P<0.01);MCF-7、MDA-MB231细胞经U0126干预24 h后,检测细胞周期及细胞凋亡,G 0/G 1期细胞比例较对照组明显增加,S及G 2期细胞比例下降(P<0.05);而干预组细胞凋亡率较未干预组明显增多(P<0.01);U0126处理人乳腺癌细胞2 h后,可阻断ERK的磷酸化,减少cyclin D1的蛋白表达,抑制survivin而上调cleaved caspase-3的表达,与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。结论 U0126通过阻断MCF-7、MDA-MB231细胞中ERK信号通路,调控cyclin D1,将细胞周期阻断在G 0/G 1期,抑制survivin而增加cleaved caspase-3表达,增加细胞凋亡,继而使乳腺癌细胞MDA-MB231、MCF-7的增殖受到抑制。

特异性MEK抑制剂U0126对玉米大斑病菌孢子萌发、附着胞产生和致病性的影响

目的研究MAPK信号转导途径对玉米大斑病菌生长、发育和致病性的调控作用,为明确玉米大斑病菌和玉米之间互作的分子机制奠定基础,对玉米大斑病的有效防治也有重要的理论意义。方法利用MEK特异性抑制剂U0126处理玉米大斑病菌,观测该抑制剂对玉米大斑病菌孢子萌发、附着胞发育和致病性的影响。结果U0126对玉米大斑的菌落形态和生长速度没有显著影响,可以形成正常的菌丝、分生孢子,但分生孢子萌发时间晚,芽管短,分生孢子萌发百分率和附着胞产生数目下降,玉米叶片的发病时间延迟2～3d,发病率下降30%左右。在一定浓度范围内,U0126对分生孢子萌发和附着胞产生的抑制程度随着浓度增加而上升,但随着处理时间的延长而下降。结论玉米大斑病菌的分生孢子萌发、附着胞产生和对感病玉米叶片的致病能力受U0126抑制的MAPK信号转导途径调节。

U0126对食管鳞癌细胞迁移的影响

目的探讨丝裂原细胞外信号调节激酶(MEK)1/2抑制剂U0126对食管鳞癌细胞迁移的影响及可能的分子机制。方法培养人食管鳞癌细胞系KYSE-150,Transwell迁移实验和划痕实验评价细胞垂直和横向迁移情况,Western印迹法检测上皮间质转化(EMT)相关标记物的蛋白表达。结果Transwell实验结果表明,与对照组相比,不同浓度U0126处理KYSE-150细胞后,细胞垂直向迁移能力明显增强(P<0.05)。细胞划痕实验结果表明,与对照组相比,不同浓度U0126处理KYSE-150细胞后,细胞水平迁移能力明显增强,除0.5μmol/L U012624 h时外,其余差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,U0126处理KYSE-150细胞后,p-ERK1/2、E-cadherin表达明显降低,β-catenin表达明显升高(P<0.05)。结论U0126以剂量依赖的方式促进KYSE-150细胞迁移,其机制可能与下调E-cadherin,上调β-catenin表达有关。

MAPKs信号阻断剂U0126对油酸致急性肺损伤大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞中AQP4表达的影响

目的观察大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ)上AQP4与MAPKs信号转导通路在早期急性呼吸窘迫综合征时的相互联系。方法实验分正常组、油酸肺损伤组及加药组。加药组给予U0126,余两组予二甲基亚砜作为对照。测动脉血气、血管外肺水(EVLW),观察肺组织病理改变评价早期肺损伤程度。急性分离纯化大鼠AT-Ⅱ,行鞣酸染色、碱性磷酸酶染色(AKP)鉴定。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肺泡Ⅱ型上皮细胞中AQP-4的mRNA的表达量。结果血气分析、肺组织HE染色、EVLW显示损伤组明显高于正常组,加药组较损伤组无明显变化。AQP4 mRNA表达损伤组最高,加药组较损伤组明显减少。结论大鼠肺泡II型细胞上AQP4mRNA在不同组的表达变化,表明急性肺损伤时启动了MAPKs信号传导通路且增加AQP4 mRNA的表达。

ERK阻滞剂U0126对白血病细胞K562细胞周期的作用及机制

目的研究细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)阻滞剂U0126对K562细胞周期的作用及机制。方法以逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和Westernblot检测U0126处理K562细胞后ERK、Cyclin D2、Cyclin E、P27 mRNA和蛋白的表达;以流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞周期的变化。结果处理后K562细胞ERK、Cyclin D2、Cyclin E mRNA和蛋白表达降低;P27 mRNA和蛋白表达增高。G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,与用药前相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论U0126可能通过ERK途径,影响细胞周期调控蛋白,最终抑制了K562细胞的增殖。

黄芩素和U0126体外抗人乳腺癌的作用及机制研究

目的:探讨黄芩素和U0126体外对乳腺癌的作用及其机制。方法:用黄芩素、U0126单独处理以及二者联合处理人乳腺癌细胞株MCF-7细胞,采用CCK8检测细胞增殖变化;流式细胞术检测MCF-7细胞周期以及凋亡变化;显微镜观察细胞数量变化;TUNEL法检测细胞凋亡改变;划痕实验分析细胞迁移情况;Western blot实验检测细胞凋亡相关因子的蛋白水平变化,分析黄芩素与U0126对乳腺癌细胞的增殖、凋亡和迁移的影响。结果:黄芩素或U0126可抑制细胞的增殖且具有浓度依赖性(P<0.05);黄芩素阻滞MCF-7细胞周期进入S期,增加G0~G1期细胞比例(P<0.05),降低S期细胞比例(P<0.05),诱导细胞凋亡(P<0.05);降低ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平和CyclinD 1的蛋白水平表达;黄芩素与U0126联合处理MCF-7细胞,与黄芩素单独处理组相比较,S期细胞比例明显降低(P<0.05),细胞凋亡更加明显(P<0.05),ERK1/2和JNK的磷酸化水平(P<0.05)、CyclinD 1的蛋白表达量降低更加明显(P<0.05);同时黄芩素可有效抑制人乳腺癌细胞株MCF-7细胞的迁移(P<0.05)。结论:黄芩素和U0126通过降低ERK1/2、JNK的磷酸化水平表达,降低CyclinD 1的水平表达,有效抑制MCF-7细胞增殖和迁移,诱导MCF-7细胞凋亡并且二者具有协同作用。因此,黄芩素和U0126联合有望用于临床治疗乳腺癌。

U0126增强索拉非尼对K562细胞增殖抑制、凋亡及诱导分化作用

目的:观察索拉非尼、索拉非尼联合MEK激酶抑制剂U0126对人慢性粒细胞白血病K562细胞株增殖、凋亡及分化的影响,并初步探讨其机制。方法:CCK-8法观察索拉非尼、U0126单用及不同浓度索拉非尼联合10μmol/L U0126作用K562细胞48 h后细胞增殖活力变化;PI单染法及Hoechst 33342染色法观察索拉非尼、U0126单用及索拉非尼联合U0126对K562细胞株的凋亡诱导作用;细胞周期分析及联苯胺染色观察索拉非尼、U0126单用及低浓度索拉非尼联合U0126是否诱导K562细胞株向红系分化;采用免疫印迹法检测c-Myc蛋白表达。结果:MEK抑制剂U0126增强了索拉非尼对K562细胞增殖抑制、促凋亡及诱导分化作用。两药联用显著下调K562细胞c-Myc蛋白水平。结论:MEK抑制剂U0126增强索拉非尼对K562细胞增殖抑制、凋亡及诱导分化作用,这可能与其协同下调c-Myc蛋白有关。

黄芩素联合U0126诱导人乳腺癌细胞株MCF-7凋亡的分子机制研究

目的探讨黄芩素和U0126诱导人乳腺癌细胞株MCF-7凋亡的分子机制。方法单独及联合使用20μmol黄芩素、10μmol U0126处理MCF-7细胞24 h;光学显微镜观察细胞数量变化,流式细胞术检测MCF-7细胞周期变化,CCK8法检测细胞增殖变化,TUNEL法和流式细胞术检测细胞凋亡,实时聚合酶链反应(Real Time PCR)和Western blot检测凋亡相关因子m RNA和蛋白的表达水平。结果与黄芩素单独刺激MCF-7细胞相比,黄芩素联合U0126刺激MCF-7细胞时,S期细胞比例降低更明显;MCF-7细胞经不同浓度黄芩素或U0126处理后,增殖抑制,且具有浓度依赖性(P<0.05);与黄芩素单独处理MCF-7细胞相比,黄芩素与U0126联合处理时,细胞凋亡更加显著(P<0.05),早期凋亡和晚期凋亡均增多(P<0.05);与黄芩素或U0126单独处理MCF-7细胞相比,黄芩素和U0126联合处理MCF-7细胞时,凋亡抑制因子Bcl-2的m RNA水平降低(P<0.05),凋亡促进因子Bax的m RNA水平增高(P<0.05),ERK1/2、GSK-3β和P38的磷酸化水平降低(P<0.05),凋亡促进因子Bax表达量增高(P<0.05),凋亡抑制因子Bcl-2表达量降低(P<0.05)。结论黄芩素或U0126通过调控Bcl-2/Bax的表达水平以及ERK1/2、GSK-3β和P38的磷酸化水平抑制MCF-7细胞增殖,促进细胞凋亡,且具有协同效应。因此,黄芩素和U0126可联合用于临床治疗乳腺癌,具有重要临床意义。

p42/44MAPK抑制剂U0126对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响

目的研究U0126对人胃癌SGC-7901细胞生物学特性的影响。方法用MTT法测定U0126对SGC-7901细胞增殖的影响,流式细胞仪检测U0126对SGC-7901细胞周期和细胞凋亡的影响,用Western blot分析p42/44和p38以及其磷酸化水平的变化。结果 10、15、20μMU0126均能够抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖;可使S和G2/M期肿瘤细胞比例减少,G0/G1期肿瘤细胞比例增加,其中20μM浓度的U0126作用最强(P<0.01);U0126诱导肿瘤细胞凋亡,其中20μM浓度的U0126凋亡作用最强(P<0.01);U0126使p-p42/44下调而使p-p38上调。结论 U0126诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖,其机制可能是抑制p-p42/44表达,并使p-p38表达增强。

MEK1/2抑制剂U0126抑制肠道病毒71型的复制

为了揭示肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)的复制与宿主细胞Raf/MEK/ERK信号通路(简称ERK通路)的相互关系,本研究应用临床诊断为手足口病的患儿疱疹液,通过易感细胞分离培养、RT-PCR及序列测定,以及Western印迹技术等方法,成功分离到EV71临床株.进一步用该分离株感染易感细胞,通过观察宿主细胞p-ERK1/2蛋白磷酸化水平、病毒特异性衣壳蛋白VP1水平、病毒半数组织培养感染量(50%tissue culture infectious dose,TCID50),以及感染细胞的CPE等指标,以期揭示ERK通路在EV71复制的作用.结果表明,EV71的复制可引起细胞ERK通路的活化;而用MEK1/2特异性的抑制剂U0126预先抑制ERK通路的活化,可显著地降低受染细胞上清液中的病毒的感染滴度(以TCID50表示)、受染细胞中EV71VP1蛋白水平、受染细胞中EV71核酸水平,以及受染细胞的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE).提示ERK信号通路的活化对EV71的复制具有重要的作用.本研究为进一步阐明EV71在宿主细胞内的复制机制、寻找新型抗病毒靶标等研究奠定了良好的基础.

U0126对imDC诱导初始性CD4^+T细胞的体外研究

目的:研究ERK1/2信号通路在imDC诱导同种异体CD4+T细胞分化为Treg细胞中的作用,探讨免疫耐受状态建立的可能分子机制。方法:密度梯度离心法从血液标本中分离PBMC,加入GM-CSF和IL-4联合诱导、扩增至第7天,使其转化为imDC,从细胞形态学、细胞表面标记物以及细胞功能三方面进行鉴定;免疫磁珠分选法从单个核细胞中分离初始性CD4+T细胞,将其混合培养,同时设空白组、混合对照组、低浓度U0126组、中浓度U0126组和高浓度U0126组,分别以FCM检测初始性CD4+T细胞转化为Treg细胞的转化率。结果:空白组:3.25%±0.89%,混合对照组:21.80%±0.40%,低浓度U0126组:22.58%±0.52%,中浓度U0126组40.81%±0.81%,高浓度U0126组:41.58%±0.81%。结论:人外周血来源的imDC可以诱导初始性CD4+T细胞转化成Treg细胞;ERK1/2信号传导通路特异性阻断剂U0126可以部分促进初始性CD4+T细胞向Treg细胞转化,表明该阻断剂在免疫耐受的诱导中起了一定的作用。

U0126对黑素瘤细胞A375侵袭的抑制作用

目的:评价U0126对人黑素瘤细胞A375侵袭的抑制作用。方法:人黑素瘤A375细胞在6孔细胞培养板中培养,加U0126处理过夜,然后通过观察A375细胞的细胞形态、细胞移动及细胞侵袭判断U0126对A375细胞的抑制。蛋白电泳试验检测U0126对黑素瘤细胞A375的ERK1/2蛋白磷酸化的影响。结果:U0126诱导A375细胞产生肌动蛋白(actin)张力丝,导致细胞形态改变;A375细胞的移动和细胞侵袭被抑制。结论:U0126可能通过抑制黑素瘤的ERK1/2蛋白的磷酸化从而抑制人黑素瘤细胞A375的侵袭。

鞘内注射U0126对吗啡戒断大鼠脊髓神经元Fos表达的影响

目的:研究鞘内注射U0126对吗啡依赖大鼠戒断反应中Fos表达的影响。方法:采用大鼠吗啡依赖及戒断模型,分为正常对照组、吗啡依赖组、吗啡戒断组、U0126组、DMSO组,运用免疫组织化学法(n=6)和Westernblot(n=4)方法观察鞘内注射U0126对吗啡戒断大鼠脊髓神经元Fos表达的影响。结果:鞘内注射U0126可明显减少L5节段脊髓背角Fos阳性神经元的数目,U0126组为287±54,低于戒断组380±71,两者差异有显著性(P<0.05)。Western blot显示U0126组Fos蛋白的表达与戒断组相比也明显减少。结论:鞘内注射U0126能明显抑制吗啡戒断大鼠脊髓神经元Fos表达。

在肿瘤细胞模型中联合应用磷脂酰肌醇3激酶/蛋白酶B通路抑制剂BEZ235和细胞外调解蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶通路抑制剂U0126的效果

目的探讨通过联合应用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白酶B(AKT)通路抑制剂BEZ235和细胞外调解蛋白激酶(ERK)通路抑制剂U0126抑制膜受体酪氨酸激酶/PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路与ERK/丝裂原活化蛋白激酶通路对细胞增殖的影响。方法以磷酸酶和张力蛋白同源物缺失(PTEN-/-)的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)系作为研究对象,联合应用PI3K、mTOR双重抑制剂BEZ235及ERK激酶抑制剂U0126,通过MTT和Western blot方法检测药物对细胞增殖的影响。结果 BEZ235及U0126对PTEN-/-MEF细胞均有抑制作用,二者半数抑制浓度分别为6.257 nmol/L及22.85μmol/L。但联合应用BEZ235与U0126,二者表现为拮抗的作用方式。结论在PTEN缺失的细胞系中或PTEN突变的肿瘤的联合靶向治疗中,不推荐应用BEZ235与U0126联合使用。

Wortmannin和U0126抑制胰岛素对大鼠骨骼肌成肌细胞的促分化作用

目的观察wortmannin和U0126抑制胰岛素对大鼠成肌细胞向成熟肌细胞分化作用,探索定向诱导肌分化的途径及其分子机制。方法分离和培养大鼠骨骼肌成肌细胞,用含不同浓度胰岛素的DMEM培养基培养,收集细胞,在相差显微镜下观察形态变化,并通过免疫细胞化学方法和Western blot法检测生肌素(myogenin)表达。用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特异性抑制剂wortmannin和MEK特异性抑制剂U0126干预后,观察胰岛素对骨骼肌成肌细胞分化的影响。结果胰岛素能明显促进骨骼肌成肌细胞形成肌小管,诱导2 d开始有肌管形成并逐渐增多到7 d达到高峰;胰岛素促进骨骼肌成肌细胞的生肌素阳性细胞核和生肌素蛋白表达增多,而wortmannin和U0126能下调胰岛素的这种作用。结论 Wortmannin和U0126可阻断胰岛素促进骨骼肌成肌细胞向成熟肌细胞分化,使肌管生成减少,生肌素表达下调。

U0126及地塞米松对氨培养SD乳鼠脑星形胶质细胞AQP4表达的影响

目的观察氨培养的脑星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)的表达,地塞米松及丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号转导通路抑制剂U0126对其表达的影响。方法分离、培养SD大鼠脑星形胶质细胞,分为氨培养组、氨培养+U0126组、氨培养+地塞米松组和正常对照组,采用免疫组织化学及逆转录聚合酶链式反应检测AQP4在蛋白和基因水平的表达和变化。结果氨可致培养的星形胶质细胞AQP4蛋白和AQP4 mRNA的表达增加。U0126和地塞米松均可使氨培养星形胶质细胞AQP4 mRNA和AQP4蛋白的表达减少。结论氨可致AQP4表达增加,U0126和地塞米松有细胞保护作用,可有效保护脑星形胶质细胞。

U0126对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖、迁移及侵袭的影响

[目的]探讨U0126对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖、迁移及侵袭的影响.[方法]用不同浓度MEK/ERK抑制剂U0126(25,50,100μmol/L)处理Tca8113细胞24,48,72 h,采用MTT法检测细胞增殖抑制情况,划痕实验检测细胞迁移距离,Transwell实验检测48 h时的细胞侵袭率,细胞免疫荧光染色和Western blot法检测48h时的细胞ERK1/2,p-ERK1/2,MEKK1,p-MEKK1在细胞内定位和蛋白表达情况及E-cadherin和Vimentin表达水平.[结果]U0126对细胞的增殖、迁移和侵袭具有明显的抑制作用(P<0.01),且呈现出浓度和时间依赖性;细胞中磷酸化的ERK1/2主要表达在细胞核膜和核内,U0126对磷酸化的ERK1/2表达具有明显的抑制作用(P<0.01);与对照组比较,U0126各剂量组E-cadherin蛋白表达水平均明显升高(P<0.01),而Vimentin蛋白表达水平明显降低(P<0.01),且均呈现出浓度依赖性.[结论]U0126可抑制Tca8113细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制认为可能与抑制ERK1/2活化、促进E-cadherin表达及抑制Vimentin表达有关系.

U0126在胰腺癌细胞解离中作用机制的实验研究

胰腺癌具有很强的侵袭转移能力,因此开发针对侵袭、转移的新型治疗方法将有助于提高胰腺癌的治疗效果。癌细胞从原发部位解离、游走是癌细胞侵袭、转移过程中最为关键的第一步。因此,揭示胰腺癌细胞解离的细胞及分子生物学过程有利于加深对胰腺癌侵袭、转移分子机制的了解．同时为开发针对胰腺癌侵袭、转移的分子靶向治疗提供了具有重要价值的新靶标。

细胞外信号调节激酶1/2抑制剂U0126上调脑缺血再灌注小鼠海马微管结合蛋白2的表达

目的探讨细胞外信号调节激酶(ERK)1/2抑制剂U0126对脑缺血再灌注损伤小鼠海马微管结合蛋白2(MAP-2)表达的影响。方法健康昆明小鼠150只,随机分为假手术组、缺血再灌注组和U0126组,每组50只,各组再根据缺血后再灌注的时间点细分为6、12、24、48和72 h 5个亚组。利用免疫组织化学方法和Western blot方法检测MAP-2在各组小鼠海马的表达变化,同时应用TUNEL法检测各组小鼠海马细胞的凋亡情况。结果与假手术组相比,缺血再灌注组小鼠海马MAP-2的表达在6 h时已经明显降低,24 h达最低值,而在72 h略有回升(P<0.01);与相同时间点的缺血再灌注组小鼠相比,U0126组小鼠海马MAP-2的表达明显升高(P<0.01),而且海马细胞的凋亡情况明显好转(P<0.01)。结论 U0126能够上调脑缺血再灌注损伤小鼠海马MAP-2的表达,减少脑缺血再灌注损伤海马神经细胞的凋亡。

MEK特异性抑制剂U0126对A549细胞的放射增敏作用及机制研究

采用克隆形成实验检测U0126对A549细胞的放射增敏作用;MTT法检测U0126联合X-射线对A549细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测U0126联合X-射线对A549细胞周期的影响;蛋白免疫印迹杂交法检测p-erk蛋白在A549细胞中的表达;衰老相关β-半乳糖苷酶染色检测A549细胞衰老的变化。结果显示,U0126使p-erk蛋白表达下降,能够增加A549细胞的放射敏感性,放射增敏比为1.18。单纯使用U0126能明显抑制A549细胞的增殖,诱导G1期细胞阻滞并具有时间依赖性和剂量依赖性。U0126联合X-射线也能抑制A549细胞的增殖,增强G1期细胞阻滞现象和细胞衰老现象。以上结果表明,U0126能增加A549细胞的放射敏感性,其作用机制可能与细胞周期阻滞及细胞衰老增强有关。