肿瘤U1 snRNA蛋白互作图谱及特征分析

目的利用CHIRP⁃MS技术系统地鉴定肿瘤细胞中U1 snRNA的互作蛋白,并建立U1 snRNA高通量互作蛋白图谱,研究U1 snRNA在肿瘤细胞中新的生物学功能和分子调控机制。方法通过带生物素标记的U1 snRNA探针捕获与U1 snRNA结合的互作蛋白,并分别取部分样品纯化蛋白和RNA,通过qPCR与跑胶银染确认探针富集效果,然后利用高效液相色谱⁃质谱联用技术鉴定获取的蛋白,最后利用生物信息学的方法进行GO、KEGG、蛋白复合体富集分析和PPI分析。结果我们共鉴定到了135个高可靠的U1 snRNA结合蛋白,其中包括60个已知的和75个新的U1 snRNA结合蛋白。通路富集等生物信息学分析显示U1 snRNA协同调控RNA剪接、胞内运输、定位、端粒和表观遗传等多个生物学过程。蛋白互作网络分析揭示ESWR1等肿瘤相关蛋白可能介导了U1 snRNA的肿瘤调控功能。结论本研究在国际上首次建立了U1 snRNA互作蛋白图谱,揭示了U1 snRNA在肿瘤细胞中的多种生物学功能,为进一步研究U1 snRNA参与肿瘤发生发展以及肿瘤预防和治疗提供了理论基础。

U1 snRNA及其在基因治疗中的应用

U1sn RNA是一种富含尿苷酸的具有酶活性的小分子量 RNA,其主要特点是剪接核内非均一性 RNA成为成熟 RNA;只存在于真核细胞核质中 ,具有在核内定位的特性。有人利用这些特性对 U1sn RNA进行人工点突变来纠正某些基因缺陷病 ,或是构建 U1sn RNA-核酶及 U1sn

Activity identification of ribozyme and U1 snRNA chimeric ribozyme against TGFβ1 in cell-free system and in hepatic Stellate cells

Transforming growth factorβ1 (TGFβ1) is known to be intimately involved inmany cellular processes. To explore the mechanism of TGFβ1 in these processes, the non-chimerichammerhead ribozyme and U1 snRNA chimeric ribozyme against TGFβ1 were designed to down-regulateTGFβ1 expression. The activity of non-chimeric ribozyme and U1 snRNA chimeric ribozyme againstTGFβ1 in vitro and in activated hepatic stellate cells (HSCs) was detected. Cleavage reactions ofboth ribozymes in vitro demonstrated that non-chimeric ribozyme possessed better cleavage activityin vitro than U1 snRNA chimeric ribozyme. The further study showed U1 snRNA chimeric ribozymeinhibited TGFβ1 expression more efficiently than non-chimeric ribozyme in transfected HSC cells. Soit indicates that the U1 snRNA chimeric ribozyme provides an alternative approach for the researchon the precise mechanism of TGFβ1 in many cellular processes and a potential therapeutic candidatefor TGFβ1-related diseases.

SV40 T抗原与人U_1和U_2 snRNA基因的特异结合

利用DNA结合免疫分析证明,编码人U_1和U_2 snRNA基因的5′端区域含有与SV40 T抗原特异结合的序列。SV40 T抗原与U_2基因的亲和力大于U_1基因。DNasel足印(footprinting)分析取得与DNA结合免疫分析一致的结果。U_1和U_2基因的5′端区域含有能被T抗原所保护的,免于DNasel降解的序列。这两个基因的两条链上都含有约30bp长的DNA被T抗原所保护。U_1基因被保护的区域在-11bp—-42bp之间,而U_2基因被保护区域是在-58bp—-90bp之间。

U1snRNA嵌合体核酶的抗丙型肝炎病毒作用

目的 鉴定特异性抗丙型肝炎病毒(HCV)核酶与具有细胞核靶向性的U1 snRNA组成的嵌合体在体外切割HCV RNA的活性。 方法 通过聚合酶链反应及克隆的方法用HCV特异性核酶(Rz)序列取代质粒pBSIISK+U1(含有人类野生型U1 snRNA基因全序)中U1 snRNA第三个茎环结构,重组质粒命名为pBSIISK+(U1-Rz)。再将pBSIISK+(U1-Rz)中核酶与U1 snRNA组成的嵌合体基因正向克隆于pGEM-T载体T7启动子的下游,重组质粒命名为pGEM-(U1-Rz)。质粒pGEM-(U1-Rz)和pGEM-Rz[含有与pGEM-(U1-Rz)相同的核酶序列]体外转录后,转录产物与靶RNAs在一定条件下进行切割反应,电泳后放射自显影。 结果 U1 snRNA嵌合体核酶构建成功。嵌合体核酶与核酶对靶RNAs均有切割活性,且二者的切割活性相似。随着时间的延长和工具酶体积比的增加切割效率增加。 结论 特异性抗HCV核酶与U1嵌合体在体外具有良好的特异性催化切割活性。

X连锁Alport综合征COL4A5剪接突变的致病性分析及剪接纠正

目的分析一个X连锁显性遗传Alport综合征家系COL4A5基因的剪接突变位点,探索外显子特异性U1核小RNA(small nuclear RNA,snRNA)基因治疗的可能性。方法收集Alport综合征先证者及其家族成员临床资料,高通量测序技术检测先证者肾病系列基因全外显子组基因突变。用在线软件分析COL4A5 c.546+5G>A变异引起的剪接位点改变及其致病性。用minigene实验验证和分析Alport综合征家系先证者COL4A5基因突变位点c.546+5G>A及瞬时转染导入修饰过的U1 snRNA纠正剪接突变的效果。结果基因测序结果显示,先证者和其同母异父的兄长均存在COL4A5基因半合子变异,变异位点为c.546+5G>A。在线软件分析剪接变异致病性的结果显示,突变后原有的Donor剪切位点检测不到,提示影响剪切可能性很大。杂交小基因检测结果验证了COL4A5基因c.546+5G>A突变的异常剪接模式——外显子9缺失。经过修饰的U1 snRNA可部分纠正该异常的剪接突变,ExSpeU1(MT)、ExSpeU1(E9+1)、ExSpeU1(E9+9)、ExSpeU1(E9+11)对c.546+5G>A引发的外显子9缺失的纠正比例分别为0、43.81%、52.09%、48.12%。结论COL4A5新发剪接突变具有致病性,修饰过的U1 snRNA可部分纠正异常剪接。