青藤碱通过调控STAT3及NF-κB信号通路对多发性骨髓瘤U266细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨青藤碱对骨髓瘤U266细胞增殖、凋亡的影响及其可能机制。方法将培养好的U266细胞用不同浓度青藤碱(0、0.5、1、2 mmol/L)处理,空白对照组加入0.5%浓度的DMSO。用CCK-8检测U266细胞的增殖;流式细胞术检测细胞的凋亡;Western blot法检测各组细胞的增殖相关蛋白、凋亡相关蛋白、信号转导与转录激活因子(STAT3)及基因结合核因子(NF-κB)信号通路相关蛋白的表达水平。结果与空白对照组比较,青藤碱处理组U266细胞凋亡率增加,增殖能力降低,抗凋亡相关蛋白Bcl-2及Mcl-1表达水平下降、cleaved caspase-3、cleaved PARP表达水平上调,STAT3、NF-κB信号通路活性降低,表现为p-STAT3、p-IκBα的表达水平下降。结论青藤碱通过下调STAT3及NF-κB信号通路活性,促进骨髓瘤U266细胞凋亡。

巢式MSP检测砷剂诱导人多发性骨髓瘤U266细胞系p16基因去甲基化及转录

本研究探讨用高灵敏度的DNA甲基化检测方法及DNA克隆测序分析法检测三氧化二砷(As2O3)的去甲基化作用,并对其可能的去甲基化作用机制进行分析。采用巢式甲基特异性PCR法(nested-methylation specificPCR,n-MSP)、DNA克隆测序分析法检测As2O3作用前后U266细胞株p16基因甲基化状态,应用RT-PCR检测p16、DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNMT3A、DNMT3B基因mRNA的表达,以生长曲线、MTT法、集落形成实验检测As2O3对骨髓瘤细胞生长和增殖的抑制作用。利用流式细胞仪DNA含量分析法探讨As2O3对多发性骨髓瘤细胞系U266周期的影响。结果表明:①未处理组U266细胞基因组DNA的胞嘧啶保持不变,而经As2O3作用的U266细胞基因组DNA的胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶,这说明U266细胞存在p16基因甲基化,As2O3作用后p16基因异常甲基化的现象被逆转;②未处理组细胞p16基因不表达,As2O3作用72小时后p16基因表达增强,0.5μmol/L组、1.0μmol/组和2.0μmol/组p16基因表达阳性条带灰度值与β-肌动蛋白比值分别为(0.22±0.10)、(0.59±0.11)、(0.68±0.09),阳性对照灰度比值为(0.77±0.13),差异有非常显著的统计学意义(P<0.01);③与未处理组相比,As2O3作用72小时后甲基转移酶(DNMT)1、DNMT3A、DNMT3B的表达下降并呈浓度依赖性;④与对照组相比,3组不同浓度As2O3均能明显抑制骨髓瘤细胞生长,G0-G1期细胞增加。结论:As2O3可能通过抑制甲基转移酶(DNMT1)、DNMT3A、DNMT3B和(或)直接对p16基因去甲基化,使p16基因表达上调,恢复其活性,从而实现其对细胞周期的调控功能,将细胞阻滞于G0-G1期,抑制骨髓瘤细胞的增长。

丙戊酸钠抑制人多发性骨髓瘤U266细胞增殖及组蛋白乙酰化调控的研究

本研究探讨丙戊酸钠(valproic acid sodium,VPA)对U266细胞增殖的抑制作用及对组蛋白乙酰化修饰调控的影响。采用CCK-8法检测VPA对U266细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测VPA作用前后U266细胞周期的变化,半定量RT-PCR检测VPA作用后U266细胞中组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)mRNA的表达变化,Western blot方法检测VPA作用后HDAC1及组蛋白H3、H4乙酰化蛋白水平的变化。结果表明,VPA对U266细胞增殖的抑制作用呈时间-浓度依赖性;2.5mmol/L的VPA处理细胞48小时后,细胞周期检测显示G0/G1期细胞比例增高,S期细胞比例下降,细胞被阻滞在G0/G1期(p<0.05);RT-PCR证实VPA能够抑制HDAC1 mRNA的表达水平;Western blot方法证实不同浓度VPA作用细胞48小时后HDAC1蛋白水平降低,组蛋白H3、H4乙酰化表达水平提高。结论:VPA能够抑制U266细胞增殖,使细胞阻滞于G0/G1期,这可能与VPA抑制HDAC1表达,上调组蛋白H3、H4乙酰化水平有关。

龙葵总提取物对多发性骨髓瘤U266细胞株的作用

目的:研究龙葵总提取物对U266细胞的细胞毒作用及其机制。方法:U266细胞株与龙葵总提取物共同培养,用CCK 8试剂检测细胞毒作用;用流式细胞仪测定细胞周期及凋亡。结果:龙葵总提取物对U266细胞有细胞毒作用,半数抑制(质量)浓度约为117mg/L;龙葵总提取物影响U266细胞周期,G0 /G1 期细胞减少,S期、G2 /M期细胞增加,凋亡细胞增加。用AnnexinV/PI染色及TFAR19染色流式细胞仪检测,均显示细胞凋亡与龙葵总提取物有剂量依赖关系。结论:龙葵总提取物对U266细胞有体外细胞毒作用,其作用机制部分是诱导细胞凋亡。

Bmi-1 shRNA慢病毒表达载体的构建及稳转U266细胞株的建立

本研究构建Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立U266-li稳定细胞株,为下一步Bmi-1的功能研究及应用RNAi技术治疗打下基础。设计、合成1对针对Bmi-1 mRNA的shRNA序列,退火后连接到pLVTHM干扰载体上,与psPAX2、PMD2G共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染U266细胞,建立稳定细胞株;应用实时PCR和Western blot技术分别检测U266稳定细胞中Bmi-1及P14 mRNA和蛋白水平的表达,并与对照组进行比较。结果表明,成功构建了针对Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,病毒滴度为5×107 TU/ml;建立稳定转染的U266细胞株。有效干扰验证显示,shBmi-1能明显降低Bmi-1的mRNA及蛋白水平,而P14的mRNA及蛋白水平则都上调,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立稳定干扰Bmi-1表达的U266细胞株。

狗舌草提取物对多发性骨髓瘤U266细胞株细胞毒作用研究

目的:研究狗舌草提取物对266细胞的细胞毒作用。方法:U266细胞株与狗舌草提取物共同培养,用CCK-8试剂检测细胞毒作用。结果:狗舌草提取物对266细胞有细胞毒作用,半数抑制(质量)浓度约为3.2mg.L-1。结论:狗舌草提取物对266细胞有体外细胞毒作用。

U266细胞对硼替佐米耐药后自噬活性的变化及机制

目的:探讨U266细胞对硼替佐米耐药后自噬活性的变化及机制。方法:MTT法检测并计算硼替佐米对U266及U266/Bor细胞的增殖抑制率、半数抑制浓度(IC_(50))、药物抗性系数、3-甲基腺嘌呤逆转U266/Bor细胞对硼替佐米耐药倍数,并绘制增殖抑制率曲线;Western blot法测定LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、磷酸化mTor、Beclin-4、ATG5、ATG7蛋白的表达。结果:硼替佐米对U266及U266/Bor细胞具有增殖抑制作用,24 h的IC_(50)分别为35.7 nmol/L和526. 5 nmol/L,药物抗性系数为14. 7,3-甲基腺嘌呤逆转耐药倍数为2. 7倍。U266/Bor细胞的LC3-Ⅱ、Beclin-1、ATG5、ATG7表达量高于U266细胞;经硼替佐米作用24 h后U266的LC3-Ⅱ、Beclin-1、ATG5、ATG7的表达较前降低,U266/Bor细胞的LC3-Ⅱ、Beclin-1、ATG5、ATG7表达均高于作用前;各组磷酸化mTor表达无统计学差异。结论:自噬的增强与U266细胞对硼替佐米耐药密切相关,自噬增强与Beclin-1、ATG5,ATG7表达的上调密切相关。

异硫氰酸苯己酯降低U266细胞株p16基因甲基化的研究

本研究探讨异硫氰酸苯己酯对p16基因高甲基化的多发性骨髓瘤U266细胞株是否有去甲基化的作用。用异硫氰酸苯己酯0、5、10μmol/L孵育U266细胞株,提取DNA备用。用亚硫酸氢盐处理正常人基因组DNA,并以此为模板进行PCR扩增。设计1组特殊荧光标记探针以构建1种检测p16基因启动子区3个CpG位点甲基化改变的芯片,特殊荧光标记探针包括1对非甲基化探针和甲基化探针,检测相邻的3个CpG位点甲基化的程度。采用基因芯片的方法,将完全未甲基化的DNA和完全甲基化的DNA混合后制成标准曲线,将U266细胞株样本处理后点在芯片上与标准曲线进行比较后得出定量检测的结果。结果表明:芯片上探针的可重复性和精确性很好,0、5、10μmol/L异硫氰酸苯己酯处理后的U266细胞株p16基因的甲基化程度分别为78.2%、61.7%、54.8%。结论:异硫氰酸苯己酯可以降低U266细胞株p16基因甲基化的程度。

20(S)-人参皂苷Rg3体外对多发性骨髓瘤U266细胞系的增殖抑制作用

目的探讨天然化合物20(S)-人参皂苷Rg3体外对多发性骨髓瘤U266细胞系的抑制作用。方法利用MTT、流式细胞仪检测20(S)-人参皂苷Rg3对细胞周期的影响及诱导凋亡作用;应用Western印迹技术检测加药后U266细胞凋亡相关蛋白caspase-3的表达。结果 20(S)-人参皂苷Rg3作用U266细胞系24、48 h的IC50值分别为(71.07±2.63)μmol/L、(44.06±3.98)μmol/L,在一定浓度范围内可抑制U266细胞系的增殖,并呈时间和浓度依赖性(P<0.05);可促进U266细胞系凋亡,并呈浓度依赖性(P<0.05);细胞周期检测,与对照组比较,G0/G1期百分比增多(P<0.05),同时S期百分比逐渐减少(P<0.05),而G2/M期百分比没有明显的变化(P>0.05);药物处理U266细胞系24 h后,Western印迹检测示随药物浓度的增加,procaspase-3表达轻度下降,cleaved caspase3显著表达上升(P<0.05)。结论在一定的浓度范围内,20(S)-人参皂苷Rg3可抑制U266细胞系的增殖,且能够诱导U266细胞系凋亡,呈剂量依赖性,诱导U266细胞凋亡可能是通过上调cleaved caspase-3的表达引起的;20(S)-人参皂苷Rg3还可以影响U266细胞系的G1/S期,使细胞阻滞在G1期,而对G2/M期无明显影响,可能是其抑制肿瘤的作用机制之一,使其成为潜在的治疗多发性骨髓瘤的新制剂。

锯叶棕提取物通过阻断STAT3通路抑制U266细胞增殖及促凋亡

目的:探讨锯叶棕提取物对U266细胞增殖的影响以及锯叶棕提取物对IL-6介导的STAT3磷酸化效应。方法:①体外培养的U266细胞加入到不同浓度的锯叶棕提取物(0.5或1.0μl/ml)培养24小时,利用流式细胞仪测定位于前G1时期的细胞百分比以检测细胞凋亡;②体外培养的U266细胞加入到锯叶棕提取物(1.0μl/ml)培养24小时,应用Western Blot检测STAT3与P-STAT3表达;③血清饥饿培养24h的U266细胞暴露于IL-6(20ng/mL,30min),另一组用锯叶棕提取物1.0μl/mL预处理3小时的这些细胞,同时应用Western Blot检测STAT3与P-STAT3表达。结果:①锯叶棕提取物诱导U266细胞凋亡具有剂量依赖性(P<0.05);②应用锯叶棕提取物预处理的U266细胞,STAT 3磷酸化水平较未经处理的STAT3磷酸化水平下降80.0%;③血清饥饿培养24h的U266细胞暴露于IL-6(20ng/mL,30min),STAT3磷酸化水平增加20倍;用锯叶棕提取物1.0μl/mL预处理3小时的这些细胞,可阻断STAT3磷酸化水平85.0%。结论:锯叶棕提取物可能通过下调IL-6介导的STAT3磷酸化水平,抑制U266细胞增殖并促凋亡。

狗舌草提取物对多发性骨髓瘤U266细胞株细胞周期调控通路蛋白cyclin A,cyclin B和cdk 1等的影响

目的研究狗舌草提取物对多发性骨髓瘤U266细胞株细胞周期调控通路蛋白cyclinA,cyclinB和cdk1等影响。方法体外培养人多发性骨髓瘤U266细胞,加入终浓度为10,5,2.5mg/L的狗舌草提取物诱导48h,Western蛋白质印迹法检测cyclinA,cyclinB和cdk1蛋白表达。结果Western印迹检测结果显示,10,5,2.5mg/L的狗舌草提取物分别作用于U266细胞48h后,与正常对照组比较,蛋白cyclinB和cdk1的表达下调,cyclinA蛋白表达上调。结论狗舌草提取物诱导U266细胞凋亡的过程中,可能存在cyclinB和cdk1蛋白的表达下调、cyclinA蛋白表达上调参与。

狗舌草提取物对多发性骨髓瘤U266细胞株细胞周期调控通路蛋白cyclinE和cdk2,p27的影响

目的研究狗舌草提取物对多发性骨髓瘤U266细胞株细胞周期调控通路蛋白cyclinE和cdk2,p27等的影响。方法体外培养人多发性骨髓瘤U266细胞,加入终质量浓度为10.0,5.0,2.5mg/L的狗舌草提取物诱导48h,Western蛋白质印迹法检测cdk2和cyclinE蛋白的表达。结果Western印迹检测结果显示,10.0,5.0,2.5mg/L狗舌草提取物分别作用于U266细胞48h后,与正常对照组比较,cdk2和cyclinE蛋白表达上调,cdk2/β-Actin,cyclinE/β-Actin比值升高,p27蛋白表达下调,P27/B-Actin比值下降。结论狗舌草提取物诱导U266细胞凋亡的过程中,可能存在cdk2和cyclinE蛋白表达上调,p27蛋白表达下调参与。

锯叶棕提取物对U266细胞凋亡相关蛋白表达的影响

目的探讨锯叶棕提取物诱导U266细胞凋亡及对U266细胞凋亡相关蛋白表达的影响。方法1)体外培养U266细胞并加入到不同浓度的锯叶棕提取物(0.5μL/mL或1.0μL/mL)培养24小时,利用流式细胞仪测定位于前G1时期的细胞百分比以检测细胞凋亡。2)体外培养U266细胞并加入到锯叶棕提取物(1.0μL/mL)培养24小时,应用Western Blot检测p27kip1、MCl-1蛋白表达。结果1)锯叶棕提取物诱导U266细胞凋亡有剂量依赖性(P<0.05)。2)U266细胞暴露于锯叶棕提取物(1.0μL/mL)培养24小时,Mcl-1减少60.0%;同时p27kip1蛋白水平表达明显增加。结论锯叶棕提取物通过调节p27kip1、MCl-1蛋白水平诱导U266细胞生长抑制和促凋亡。

马钱子碱诱导人多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡与bax基因的表达

背景:马钱子碱具有抗肿瘤作用,而其对人多发性骨髓瘤细胞生长的影响尚不明确。目的:探讨马钱子碱诱导人多发性骨髓瘤U266细胞凋亡的机制。方法:取对数生长期的U266细胞,分别用0,0.05,0.1,0.2,0.4g/L的马钱子碱干预12,24,48h,通过MTT法测得IC50,并以此浓度干预U266细胞,通过形态学观察、RT-PCR法检测马钱子碱对人多发性骨髓瘤U266细胞株的诱导凋亡作用。结果与结论:马钱子碱诱导U266的凋亡呈时间和浓度依赖性(P<0.05),其作用48h的IC50为0.16g/L。在马钱子碱诱导的凋亡细胞中可见凋亡小体,同时,细胞中的促凋亡基因bax的表达量随马钱子碱作用时间的延长逐渐增加(P<0.01)。说明0.4g/L浓度范围内的马钱子碱具有诱导U266细胞凋亡的作用,这种作用具有浓度和时间依赖性,可能是通过激活bax基因途径实现的。

松油烯-4-醇对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨松油烯-4-醇（T4O）对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖及凋亡的影响及其作用机制。方法不同浓度（5~80μmol/L）T4O体外作用于U266细胞。CCK-8法检测增殖抑制率;AO/EB染色,倒置显微镜观察细胞凋亡形态;比色法检测Caspase-3酶活性;流式细胞术检测细胞凋亡及周期;JC-1染色检测细胞线粒体膜电位。结果 T4O对U266细胞有增殖抑制作用,呈时间-剂量依赖性（P〈0.05）。T4O诱导U266细胞凋亡,呈剂量依赖性（P〈0.05）,随药物浓度增加,Caspase-3酶活性逐渐增强（P〈0.05）,线粒体膜电位逐渐降低（P〈0.05）,细胞周期被阻滞在G2期。结论 T4O对U266细胞有抑制增殖及促凋亡作用,其机制是激活细胞凋亡途径关键酶Caspase-3,使细胞线粒体膜电位降低,并且使细胞周期阻滞在G2期,进而抑制肿瘤细胞分化与增殖。

白桦脂酸联合硼替佐米诱导U266细胞凋亡及其机制研究

目的：探讨白桦脂酸（BA）联合硼替佐米诱导多发性骨髓瘤（MM）U266细胞凋亡及其机制。方法：用不同浓度的BA（20、40、60及80 mg/L）、硼替佐米（10、80及320 nmol/L）、40 mg/L BA分别联合10、80及320 nmol/L硼替佐米（联合1~3组）处理U266细胞,MTT法检测上述各组U266细胞增殖抑制率;Real-time PCR和蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测40 mg/L BA、80 nmol/L硼替佐米及40 mg/L BA联合80 nmol/L硼替佐米（联合4组）的U266细胞Survivin、Cyto-C、BCL-2及Bax的mRNA和蛋白表达水平。结果：联合1~3组对U266细胞增殖抑制率显著高于BA组和硼替佐米组（P〈0.05）;与硼替佐米组和BA组相比,联合4组U266细胞的cyto-C,Bax mRNA和蛋白表达水平显著升高（P〈0.05）,而Survivin、Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平显著降低（P〈0.05）。结论：BA联合硼替佐米可以促进MM肿瘤细胞凋亡,机制可能与下调Survivin、Bcl-2表达,上调Cyto-c、Bax表达有关。

白桦脂酸联合沙利度胺诱导U266细胞凋亡机制研究

目的:探讨白桦脂酸联合沙利度胺诱导多发性骨髓瘤(MM)U266细胞凋亡的机制。方法:分别用白桦脂酸(20、40、60和80 mg/L,白桦脂酸组)、沙利度胺(10、50和100 mg/L,沙利度胺组)及白桦脂酸(40 mg/L)联合沙利度胺(联合组,白桦脂酸40 mg/L,沙利度胺10、50和100 mg/L)分别处理U266细胞,同期设对照组;MTT法和流式细胞术分别检测不同浓度白桦脂酸组、沙利度胺组及联合组U266细胞增殖抑制率和凋亡率;Real-time PCR检测4组U266细胞中Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax mRNA的表达,蛋白免疫印迹法检测4组U266细胞中Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果:随着白桦脂酸浓度的增加,U266细胞增殖抑制率增加,差异有统计学意义(P<0.05),最适浓度为40 mg/L;与沙利度胺组相比,联合组U266细胞的增殖抑制率和凋亡率明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与沙利度胺组或白桦脂酸组相比,联合组U266细胞中Survivin、Bcl-2 mRNA的表达明显降低,Cyto-C和Bax mRNA表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与沙利度胺、白桦脂酸组相比,联合组U266细胞中Survivin、Bcl-2蛋白表达明显降低,Cyto-C和Bax蛋白表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:白桦脂酸联合沙利度胺可以促进多发性骨髓瘤U266细胞凋亡,其机制可能与凋亡分子Survivin、Bcl-2、Cyto-c和Bax相关。

异硫氰酸苯已酯诱导骨髓瘤U266细胞P16基因去甲基化

目的研究异硫氰酸苯己酯(PHI)对骨髓瘤U266细胞株P16基因的去甲基化作用并探讨其作用机制。方法应用半定量逆转录-聚合酶链反应检测U266细胞经过PHI处理后DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因的mRNA的表达变化,用甲基化特异性聚合酶链反应检测PHI作用前后U266细胞株P16基因甲基化状态的变化。结果使用不同浓度的PHI处理U266细胞72h后,U266细胞表达DNMT1、DNMT3a、DNMT3bmRNA的水平明显降低并呈浓度依赖性。以不同浓度的PHI处理U266细胞10d后,P16基因的甲基化状态被逐渐逆转。结论 PHI可能通过抑制DNA甲基转移酶的表达水平诱导P16基因产生去甲基化,使失活的抑癌基因重新激活,诱导瘤细胞凋亡。

神经节苷脂GM3诱导U266细胞凋亡及作用机制研究

目的:探讨神经节苷脂GM3对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用及其可能的作用机制。方法:MTT法和流式细胞术检测不同浓度GM3作用U266细胞48 h后细胞增殖抑制及凋亡水平;实时荧光定量PCR检测不同浓度GM3对BCL-2、BAX mRNA表达水平的影响。结果:神经节苷脂GM3可以诱导U266细胞凋亡并抑制其增殖,且随着GM3浓度增加作用增强(早期凋亡率相关系数r=0.765,P<0.05;细胞增殖抑制率相关系数r=0.899,P<0.05);与对照组比较,实验组随着GM3浓度增加,凋亡基因BAX mRNA相对表达量逐渐升高(r=0.968,P<0.05),而抗凋亡基因BCL-2 mRNA相对表达量逐渐降低(r=-0.727,P<0.05)。结论:GM3可诱导U266细胞凋亡并抑制其增殖,且具有浓度依赖性。

三氧化二砷诱导U266细胞p16基因重新表达

背景与目的:DNA甲基化调节基因表达,且与肿瘤发生相关,干扰抑癌基因甲基化可能成为防治肿瘤的新途径。细胞内砷代谢和DNA甲基化都需要S-腺苷蛋氨酸作为甲基供体。本文拟探讨三氧化二砷(arsenictrioxide,As2O3)诱导因高甲基化失活的抑癌基因p16重新表达的可能性及其机制。方法:以p16基因高甲基化失活的人骨髓瘤细胞系U266为研究对象,经不同浓度As2O3处理后,采用限制性内切酶HpaⅡ及其同裂酶MspⅠ结合PCR技术,检测基因组DNA及p16基因甲基化状态;RT-PCR技术检测p16基因和DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferases,DNMTs)mRNA表达;Westernblot技术检测P16蛋白表达。结果:(1)U266细胞具有p16基因高甲基化并失表达的特点,即基因组DNA经MspⅠ酶切后电泳呈“涂抹”现象,而经HpaⅡ酶切后与未经酶切的DNA一样均呈单一条带;经MspⅠ酶切后的DNA不能经PCR扩增出p16基因产物,而HpaⅡ酶切后的DNA与未经酶切的DNA一样均能扩增出340bp的p16基因产物;RT-PCR法检测U266细胞无p16mRNA产物,Westernblot检测也未见P16蛋白带。(2)0.5～2.0μmol/LAs2O3处理后的U266细胞DNA经HpaⅡ酶切后电泳呈“涂抹”现象,也不再能扩增出p16基因产物。1.0μmol/L和2.0μmol/LAs2O3处理的U266细胞还扩增出p16基因mRNA产物;Westernblot也检测到P16蛋?