异硫氰酸苯己酯降低U266细胞株p16基因甲基化的研究

本研究探讨异硫氰酸苯己酯对p16基因高甲基化的多发性骨髓瘤U266细胞株是否有去甲基化的作用。用异硫氰酸苯己酯0、5、10μmol/L孵育U266细胞株,提取DNA备用。用亚硫酸氢盐处理正常人基因组DNA,并以此为模板进行PCR扩增。设计1组特殊荧光标记探针以构建1种检测p16基因启动子区3个CpG位点甲基化改变的芯片,特殊荧光标记探针包括1对非甲基化探针和甲基化探针,检测相邻的3个CpG位点甲基化的程度。采用基因芯片的方法,将完全未甲基化的DNA和完全甲基化的DNA混合后制成标准曲线,将U266细胞株样本处理后点在芯片上与标准曲线进行比较后得出定量检测的结果。结果表明:芯片上探针的可重复性和精确性很好,0、5、10μmol/L异硫氰酸苯己酯处理后的U266细胞株p16基因的甲基化程度分别为78.2%、61.7%、54.8%。结论:异硫氰酸苯己酯可以降低U266细胞株p16基因甲基化的程度。

山核桃叶总黄酮诱导人多发性骨髓瘤U266细胞株凋亡作用研究

目的研究山核桃叶总黄酮诱导人多发性骨髓瘤(U266)细胞株凋亡的作用及其作用机制。方法体外培养U266细胞,CCK-8比色法检测细胞增殖活性,流式细胞术定量分析细胞凋亡程度,Western Blot分析不同浓度总黄酮对U266细胞蛋白激酶B(Akt)和p-Akt蛋白表达的影响。结果山核桃叶总黄酮以浓度依赖性方式显著诱导U266细胞株凋亡并抑制p-Akt蛋白的表达。结论山核桃叶总黄酮诱导U266细胞凋亡的作用与其抑制Akt磷酸化相关。

塞来昔布对U266细胞株增殖和凋亡的研究

目的观察环氧化酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布对骨髓瘤细胞株U266细胞的增殖抑制和凋亡诱导的影响,并通过比较单用塞来昔布和加用Caspase-3阻断剂Ac-DEVD-FMK后的U266细胞株的凋亡率以及Caspase-3的表达,探讨其诱导U266细胞株凋亡的分子机制。方法骨髓瘤细胞株U266细胞经不同浓度的塞来昔布处理后,应用CCK-8体外药物筛选法测定受试样品塞来昔布对人骨髓瘤细胞U266体外增殖有无抑制作用及作用强弱;Annexin V-FITC染色流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法测定不同实验组样品中Caspase-3总量的表达。结果塞来昔布浓度>40μmol/L能抑制人骨髓瘤细胞U266体外增值,并呈浓度依赖性,IC50=66.83μmol/L。塞来昔布在40～120μmol/L浓度范围内能诱导人骨髓瘤细胞U266细胞凋亡,呈浓度依赖性。用Ac-DEVD-FMK阻断Caspase-3活性,塞来昔布诱导的U266细胞凋亡明显受抑。结论塞来昔布可诱导骨髓瘤细胞株U266细胞株凋亡,其机制涉及Caspase-3依赖性凋亡调节信号通路。

三氧化二砷对人骨髓瘤细胞株U266作用的研究

目的研究三氧化二砷(As2O3)对多发性骨髓瘤细胞株U266的作用。方法应用不同浓度的As2O3处理U266,采用细胞培养、流式细胞测定、原位杂交和酶联免疫吸附测定技术检测As2O3对U266的细胞活力、细胞凋亡、癌基因bcl-2表达和血管内皮细胞生长因子(VEGF)分泌的影响。结果As2O3可抑制U266的细胞活力,诱导细胞凋亡,抑制细胞bcl-2表达和VEGF的合成,VEGF可部分阻断As2O3的作用。结论As2O3可以通过多种机制发挥抗肿瘤作用。

U266/BOR耐药细胞株的构建及其生物学活性鉴定

目的:建立人对硼替佐米(BOR)耐药的多发性骨髓瘤U266细胞株(U266/BOR),并检测其生物学特性。方法:应用小剂量诱导和剂量递增联合诱导法建立耐药细胞株U266/BOR;在倒置显微镜下观察细胞的形态;应用MTT法测定两种细胞的BOR半数抑制浓度(IC50)和耐药系数;绘制两种细胞的生长曲线并计算二者的倍增时间;流式细胞术检测两种细胞的细胞周期,RT-PCR法检测两种细胞的相关耐药基因mRNA水平。结果:成功建立了耐药系数为19.8的耐药细胞系U266/BOR;二者细胞形态上未见明显差别;U266/BOR较U266细胞生长缓慢,其G_0/G_1期比例增加,S期比例减少;U266/BOR细胞中耐药基因PTPROt、Beclin 1及PTEN的mRNA表达减少,而c-Maf的mRNA含量增加,但MDR1的mRNA表达量无明显差别。结论:成功构建人对BOR耐药的MM细胞株U266/BOR,为BOR耐药机制的深入研究提供了理想细胞模型。

橘皮化合物5⁃ATAN诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡及其机制研究

目的探讨橘皮提取物(5⁃ATAN)对多发性骨髓瘤细胞U266增殖和凋亡的影响及其机制。方法用6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的5⁃ATAN处理对数生长期U266细胞24h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电位,Western blotting法检测细胞色素C、BCL⁃2、BAX、pro⁃caspase 3、pro⁃caspase 9及cleaved⁃caspase 3、cleaved⁃caspase 9、PARP、Bad、p⁃Bad的表达。结果5⁃ATAN对U266细胞的增殖有抑制作用,呈剂量依赖性(P<0.05);细胞凋亡率随药物浓度的增加显著增加(P<0.05),线粒体膜电位随5⁃ATAN浓度的增加显著降低(P<0.05)。抗凋亡蛋白Bcl⁃2、p⁃Bad及pro⁃caspase 3、pro⁃caspase 9及PARP的表达逐渐降低;细胞色素C及促凋亡蛋白Bax、cleaved⁃caspase 3、cleaved⁃caspase 9、PARP(89KDa)的表达逐渐升高(P<0.05)。结论5⁃ATAN抑制多发性骨髓瘤的增殖,促进其凋亡,可能与线粒体凋亡信号通路的激活有关。

环氧合酶-2对多发性骨髓瘤细胞血管内皮生长因子表达的调节作用

目的探讨多发性骨髓瘤(MM)细胞中环氧合酶-2(COX-2)对血管内皮生长因子(VEGF)表达的调控作用及其临床意义。方法应用人淋巴细胞分离液提取43例多发性骨髓瘤患者骨髓中的单个核细胞,Western blotting(WB)方法检测COX-2及VEGF的蛋白表达,分析其与MM的国际分期系统(ISS)分期、预后的相关性;RT-PCR方法检测多发性骨髓瘤U266细胞COX-2及VEGF mRNA的表达;MTT方法检测COX-2特异性抑制剂对多发性骨髓瘤U266细胞的生长抑制效应。结果多发性骨髓瘤细胞患者COX-2及VEGF过度表达,与ISS分期及预后密切相关;年龄、β2-微球蛋白(β2-MG)、血钙(Ca)及骨髓中浆细胞百分比(BMPC)等预后指标与COX-2的相关系数分别为0.692,0.791,0.571及0.856,与VEGF的相关系数分别为0.731,0.645,0.511及0.823;应用选择性COX-2抑制剂塞来昔布作用于U266细胞48 h,VEGF mRNA及蛋白的表达明显下调,与未处理组相比,统计学差异显著(P<0.01)。结论 COX-2与VEGF高表达于多发性骨髓瘤患者,与疾病的ISS分期及预后密切相关,干预COX-2可部分下调VEGF的表达,COX-2可望成为多发性骨髓瘤治疗的靶点。

多发性骨髓瘤细胞中胰岛素样生长因子结合蛋白7的基因表达及甲基化调控

目的:研究多发性骨髓瘤细胞株U266中胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)的表达及甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-dc)对其增殖的影响。方法:体外培养多发性骨髓瘤细胞株U266,并以健康查体者的骨髓单个核细胞(N-BMMNC)作为正常对照,提取RNA,采用实时RT-PCR检测IGFBP7的表达,提取细胞DNA甲基化修饰后采用甲基化特异性PCR(MSP)分析其CpG岛的甲基化状态,不同浓度的甲基转移酶抑制剂5-aza-dc(5、10和20μmol/L)处理U266细胞株,在48 h收集细胞,用实时RT-PCR和蛋白印迹法检测各组IGFBP7 mRNA和蛋白表达,流式细胞术检测药物处理前后各组细胞的细胞凋亡及细胞周期。结果:U266细胞IGFBP7 mRNA表达较正常骨髓细胞降低;MSP检测显示U266 IGFBP7的启动子CpG岛明显甲基化;不同浓度的5-aza-dc处理U266细胞株48 h后,IGFBP7的mRNA表达呈剂量依赖性增高(r=0.952,P<0.05),IGFBP7蛋白表达呈剂量依赖性增高(r=0.983,P<0.05);随着药物浓度增高,U266在G_0/G_1期细胞逐渐增多(r=0.966),细胞凋亡率逐渐增加(r=0.958)。结论:U266细胞中IGFBP7 mRNA较N-BMMNC低表达,与CpG岛的异常甲基化相关,5-aza-dc可以使U266细胞中IGFBP7mRNA和蛋白表达恢复。

MicroRNA-15a抑制骨髓瘤细胞生长及其机制研究

目的:研究microRNA-15a(miR-15a)在多发性骨髓瘤(MM)细胞生长中的作用及可能机制。方法:慢病毒颗粒感染MM细胞株U266和RPMI8226,流式细胞术(FCM)分选获得稳定转染MM细胞株。CCK-8法检测miR-15a高表达前后MM细胞的增殖情况;AO/EB染色、Hoechst 33258荧光染色法及FCM检测miR-15a高表达前后MM细胞凋亡的情况;FCM检测miR-15a高表达前后MM细胞周期的情况;real-time PCR方法检测miR-15a高表达前后MM细胞miR-15a、BMI-1及BCL-2 mRNA的表达;Western blot方法检测miR-15a高表达前后MM细胞BMI-1蛋白表达。结果:获得高表达miR-15a的MM稳定转染细胞株。CCK-8结果显示miR-15a高表达可抑制M M细胞(U266和RPM I8226)的增殖;AO/EB、Hoechst 33258染色和FCM结果显示,miR-15a高表达可显著诱导MM细胞(U266和RPM I8226)的凋亡,U266和RPM I8226细胞高表达组与对照组细胞凋亡率分别为:90.52%vs37.08%,59.40%vs 44.17%;同时,miR-15a高表达可诱导MM细胞(U266和RPM I8226)G1期阻滞,G1期细胞分别为(41.50±0.64)%、(45.31±0.77)%。real-time PCR结果显示,在高表达miR-15a抑制骨髓瘤细胞生长的过程中BCL-2 mRNA表达显著降低,BMI-1 mRNA表达则没有改变,但是Western blot结果却显示BMI-1蛋白表达出现显著降低。结论:miR-15a高表达通过诱导骨髓瘤细胞周期阻滞和凋亡抑制骨髓瘤细胞生长,其机制涉及miR-15a在转录后水平对BMI-1、BCL-2基因的负调控。

靶向抑制miR-21对多发性骨髓瘤细胞凋亡、增殖的影响及其作用机制的初步研究

目的:研究miR-21对多发性骨髓瘤细胞增殖及凋亡产生的作用,初步探讨其作用机制。方法:qRTPCR法检测miR-21在多发性骨髓瘤各细胞株中的表达水平。将miR-21抑制物及其阴性对照物转染至U266细胞株,RT-PCR法检测U266细胞miR-21的表达变化,CCK-8法检测miR-21对U266细胞增殖的影响,流式细胞术分析miR-21对U266细胞凋亡的作用,Western blotting检测U266细胞中PETN及FOXO1蛋白表达水平。结果:转染后实验组miR-21相对表达水平为0. 286±0. 031,低于阴性对照组(1. 015±0. 14)(P <0. 05)。实验组U266细胞的增殖抑制率为(53. 04±0. 02)%,显著高于阴性对照组[(20. 89±0. 17)%](P <0. 05);流式分析显示实验组U266细胞比阴性对照组凋亡明显增加[(28. 53±3. 23)%vs(5. 12±0. 63)%],差异具有统计学意义(P <0. 05)。Western blotting结果显示,与阴性对照组、空白对照组相比,实验组U266细胞的PTEN、FOXO1蛋白表达水平均上调(P <0. 05)。结论:靶向抑制miR-21可以促进多发性骨髓瘤细胞凋亡,抑制细胞增殖,这种作用可能是通过上调PTEN和FOXO1水平来实现的。

氯喹增敏地塞米松或辐射对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用

目的 研究氯喹（chloroquine,CQ）,及CQ是否增敏化疗药物地塞米松（dexamethasone,DEX）或辐射对多发性骨髓瘤细胞株U266细胞的杀伤作用,并探讨其可能机制。方法 用细胞活性检测试剂盒（cell counting kit-8,cck8）检测CQ单药,以及CQ联用DEX对U266细胞增殖的影响,运用中效原理软件评估两药相互作用;cck8及流式细胞术分别检测CQ处理条件下辐射对U266细胞增殖和凋亡作用的改变;Western blot检测CQ合用DEX,以及CQ联合辐射对U266细胞内B细胞淋巴瘤-2（B-cellymphoma-2,Bcl-2）蛋白表达变化。结果 CQ及DEX对U266细胞的增殖抑制作用呈浓度依赖性,且CQ（3.9μmol/L）能够增强DEX（125μmol/L）对U266细胞的杀伤作用,并增加DEX降低细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平;不同辐射剂量（5～25 Gy）对U266细胞的生长抑制作用并无差异;CQ（1.0μmol/L）可以增加辐射对U266细胞的敏感性,诱导细胞凋亡。结论 CQ能够增敏DEX或辐射对U266细胞的杀伤作用,CQ增敏DEX的作用机制可能与抑制Bcl-2蛋白表达相关。

马钱子碱经死亡受体途径诱导人类多发性骨髓瘤U266细胞凋亡

目的 探讨马钱子碱诱导人类多发性骨髓瘤U266细胞凋亡的机制.方法 通过MTT法、流式细胞术、RT-PCR法检测及形态学观察马钱子碱诱导人类多发性骨髓瘤U266细胞株凋亡的途径.结果 马钱子碱诱导U266的凋亡呈时间和浓度依赖性,48 h IC50 0.16 mg/ml.Hoechst 33258染色后在荧光显微镜下观察到明显的凋亡小体.Rhodamine 123染色后流式细胞术检测马钱子碱不同浓度下线粒体膜电位的变化差异无统计学意义（P＞0.05）.RT-PCR检测到马钱子碱作用12、24、48 h后Caspase-3表达量增加,其灰度值（0.2597±0.020）、（0.5488±0.016）、（0.6205±0.006）、（0.6533±0.009）（P＞0.05）;分别加入Caspase-8与Caspase-9的特异抑制剂z-IETD-fmk、z-LEHD-fmk后检测Caspase-3的表达变化,其灰度值分别为（0.7118±0.006）、（0.2637±0.003）（P＜0.01）;（0.7182±0.004）、（0.7195±0.003）（P=0.836）,提示Caspase-8被激活.结论 在0.4 mg/ml浓度范围内,马钱子碱具有诱导U266细胞凋亡作用,激活Caspase-8经死亡受体途径诱导U266细胞株凋亡.

HSP27介导多发性骨髓瘤细胞诱导硼替佐米耐药的机制研究

目的探讨多发性骨髓瘤(MM)细胞株U266中热休克蛋白27(HSP27)诱导硼替佐米(BTZ)耐药的机制研究。方法BTZ浓度逐步递增诱导建立耐药细胞株(U266/BTZ),细胞计数试剂盒(CCK8)法检测耐药细胞株的耐药性;实时荧光定量PCR及蛋白印迹法检测BTZ处理前后U266及U266/BTZ细胞中HSP27的表达;采用HSP27-siRNA干扰U266/BTZ细胞中HSP27表达,实时荧光定量PCR及蛋白印迹法进一步分析HSP27-siRNA干扰后对细胞凋亡以及内质网应激的影响,包括cl-Caspase3、cl-Caspase8、cl-Caspase9。结果CCK8结果显示,U266/BTZ细胞株能够对多种药物产生细胞耐药性。BTZ暴露显著上调U266以及U266/BTZ细胞中HSP27 mRNA和蛋白表达(P均<0.01);HSP27-siRNA干扰能够显著下调HSP27的表达;HSP27-siRNA干扰能够增强BTZ诱导的U266/BTZ细胞凋亡,增加活化Caspase3、Caspase8和Caspase9蛋白表达水平(P均<0.01)。结论HSP27介导的MM耐药是通过抑制内质网应激,从而减少骨髓瘤细胞凋亡导致。