微管抑制及尾桥蛋白磷酸化促进骨肉瘤细胞U2OS微核形成

目的探讨微管及微管相关蛋白尾桥蛋白在肿瘤细胞微核形成中的作用。方法利用DAPI染色检测不同类型细胞自发微核率;利用诺考达唑(nocodazole)抑制微管聚集后,DAPI染色和胞质分裂阻滞(cytokinesis-block,CB)微核实验观察人骨肉瘤细胞株U2OS中微核形成情况;免疫荧光多重染色检测诺考达唑处理不同时间对U2OS细胞中微管及尾桥蛋白的影响;在U2OS细胞中过表达尾桥蛋白或利用collybistin使尾桥蛋白磷酸化,再利用免疫荧光及DAPI染色检测其对微管及微核形成的影响。结果相对于人胚肾HEK293细胞和原代神经细胞,U2OS自发微核率更高;诺考达唑处理使U2OS细胞微核数量增加,且与释放时间相关;诺考达唑处理使尾桥蛋白分布改变,逐渐聚集于细胞核;U2OS细胞中磷酸化尾桥蛋白主要表达于分裂期细胞;过表达尾桥蛋白和(或)增加其磷酸化水平并不影响U2OS细胞中微管蛋白的表达,但过表达尾桥蛋白并增加其磷酸化水平可使微核数量增多。结论肿瘤细胞内微核形成与微管聚集能力关系密切,可形成于细胞周期不同时期,具有积累效应。尾桥蛋白磷酸化后细胞中微核数量增多,提示其可能参与调节肿瘤细胞微核形成。

Atg2基因敲除对人骨肉瘤U2OS细胞增殖和迁移的影响

目的 探讨自噬相关基因2(Autophagy-related gene 2,Atg2)对人骨肉瘤U2OS细胞增殖和迁移的影响。方法 蛋白质免疫印迹法鉴定两组细胞,即腺病毒介导CRISPR/Cas9系统靶向剪切AAVS1位点的基因未敲除组(AAVS1细胞)和Atg2ab基因双敲除组(Atg2ab DKO细胞);细胞划痕实验和Transwell小室法检测两组细胞的迁移能力;CCK-8法和细胞平板克隆形成实验检测两组细胞的增殖能力。结果 Atg2ab DKO细胞在24、48及72 h的光密度值(OD值)均较对照AAVS1细胞有所降低,但在72 h时,两种细胞的OD值差异有统计学意义(P<0.01)。Atg2ab DKO细胞形成的克隆数量少于对照组AAVS1细胞(6.33±2.31 vs15.00±1.00),差异有统计学意义(P<0.01)。Atg2ab DKO细胞创面愈合率(0.22±0.05)%显著低于对照组AAVS1细胞(0.82±0.05)%,差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组AAVS1细胞相比,Atg2ab DKO细胞穿过Transwell小室的细胞数量显著减少(308.11±64.68 vs 79.78±48.95)(P<0.01)。结论 Atg2基因敲除有效抑制U2OS细胞的迁移和增殖等生物学功能,Atg2基因可能在人骨肉瘤发展中发挥重要作用。

下调HMGA2基因表达对改善骨肉瘤U2OS细胞恶性表型的实验研究

目的:研究HMGA2表达在维持人骨肉瘤U2OS细胞恶性表型中的作用,为基因靶向治疗提供理论依据。方法:采用基于DNA的shRNA表达载体HMGA2-shRNA,稳定转染人骨肉瘤U2OS细胞,下调其HMGA2表达水平,并应用RT-PCR技术检测其对HMGA2基因的沉默效果;经Cell Counting Kit-8(CCK8)测定、Hoechst33342染色荧光显微镜观察及Boyden小室法分别检测细胞增殖、凋亡及迁移情况;实时定量RT-PCR检测mRNAs表达水平。结果:稳定转染靶向HMGA2的shRNA可特异性下调U2OS细胞HMGA2 mRNA表达水平;其作用结果使细胞的增殖和迁移能力受到明显抑制,自发凋亡率及Caspase 3和Caspas 9基因表达水平显著升高。结论:HMGA2基因异常表达在维持人骨肉瘤U2OS细胞恶性表型中起重要作用,靶向HM-GA2的基因治疗可能为骨肉瘤治疗带来新希望。

构建裸鼠皮下荷瘤模型:人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B

背景:多种细胞株参与骨肉瘤动物模型的和构建。目的:比较人骨肉瘤细胞株中MG63、U2OS和143B在裸鼠皮下的成瘤情况,为骨肉瘤的动物实验研究奠定基础。方法:将18只裸鼠随机等分成3组:MG63组、U2OS组和143B组,分别于各组裸鼠后侧背部皮下注射MG63、U2OS和143B三种细胞株,观察成瘤情况。结果与结论:MG63和U2OS细胞株注射的裸鼠未能成瘤。143B细胞株注射的裸鼠于(6±1)d成瘤,成瘤率100%(6/6),肿瘤生长较迅速,2个月时平均瘤体体积为(3 475±1 544)mm3,荷瘤裸鼠存活时间为(68±10)d。苏木精-伊红染色显示瘤体组织中可见癌细胞成巢,核大深染,多分裂。说明143B细胞株成瘤良好,可用于骨肉瘤动物实验研究。

PEEK-SPEEK-HA复合材料与U2OS细胞相容性研究

体外培养U2OS细胞,通过噻唑蓝（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltet razolium bromide,MTT）法研究新型聚醚醚酮-羟基磷灰石（polyetheretherketone-hydroxyapatite,PEEK-HA）生物复合材料对细胞增殖的影响.研究发现,聚醚醚酮-磺化聚醚醚酮-羟基磷灰石（polyetheretherketone-sulfnated polyetheretherketone-hydroxyapatite,PEEK-SPEEK-HA）复合材料的细胞增殖作用较PEEK-HA复合材料强,且随着HA含量的增加细胞增殖作用增强,材料浸提液质量浓度为4-8 mg/m L时对细胞有较好的增殖促进作用.复合材料毒性级别为Ⅰ,对细胞无毒性.测定黏附率研究该材料对U2OS细胞的黏附特性,PEEKSPEEK-HA复合材料随着HA含量的增大,细胞黏附率增加,高于PEEK-HA复合材料组,表明加入HA和SPEEK能改善复合材料的黏附性能.采用流式细胞术研究材料对细胞凋亡的影响,发现加入SPEEK的PEEK-HA复合材料能抑制细胞发生早期凋亡,从而降低凋亡率.激光共聚焦和流式细胞仪检测该材料对细胞活性氧的影响发现,SPEEK引入复合材料能够降低细胞活性氧水平,降低细胞毒性.扫描电镜实验表明,U2OS细胞能够在PEEK-SPEEK-HA复合材料表面黏附、伸展和生长.

人端粒酶逆转录酶基因转染U2OS细胞对其基质金属蛋白酶2活性的影响

目的:观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因转染U2OS细胞对其基质金属蛋白酶2(MMP-2)的影响,探讨hTERT基因与端粒酶的关系及端粒酶活性在肿瘤浸润和转移中的作用。方法:利用重组质粒PCI-Neo-hTERT转染人骨肉瘤细胞系U2OS,选取转染的2个阳性克隆株进行实验,同时以未转染的U2OS细胞为对照。通过RT-PCR和TRAP-ELISA法检测阳性克隆株hTERT基因的转染效果,明胶酶谱法和RT-PCR检测转染hTERT基因对细胞MMP-2的表达和活性的影响。结果:与对照组比较,2个阳性克隆株可见特异性hTERT表达,并表现出明显的端粒酶活性状态(ΔA>0.2 U)。阳性克隆株MMP-2 mRNA的表达无明显改变(P>0.05),而酶原型MMP-2减少(P<0.01)。结论:hTERT稳定转染克隆U2OS细胞株中异位表达hTERT可以产生端粒酶活性,而且端粒酶活性的出现,可能通过调节MMP的分泌影响细胞外基质成分的降解和构建而对肿瘤的浸润和转移产生一定影响。

葡萄籽提取物对人骨肉瘤U2OS细胞抑制作用及机制的研究

目的探讨葡萄籽提取物(GSE)对人骨肉瘤U2OS细胞的抑制作用及其作用机制。方法选用不同浓度的GSE作用于骨肉瘤U2OS细胞,MTT法检测其生长抑制作用;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Transwell迁移实验检测细胞迁移能力;实时RT-PCR和Western blot检测CDC20mRNA和蛋白的表达水平。结果 MTT结果显示GSE对人骨肉瘤U2OS细胞的生长抑制作用呈浓度依赖性;流式细胞术显示GSE具有诱导U2OS细胞凋亡的作用;Transwell实验显示GSE可以抑制U2OS细胞的迁移作用;RT-PCR和Western blot结果显示GSE可以下调CDC20mRNA和蛋白的表达水平。结论 GSE具有抑制骨肉瘤U2OS细胞生长及迁移、诱导细胞凋亡的作用。GSE对骨肉瘤细胞的抑制作用可能与下调CDC20表达有关。

siRNA对骨肉瘤U2OS细胞株MDM2-mRNA表达的抑制作用

目的研究载体介导的siRNA(small interfere RNA)技术对骨肉瘤细胞株U2OS中MDM2-mRNA表达的抑制作用。方法依据设计siRNA的原则,以MDM2为靶基因设计并合成有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆到载体PGCsilencerTM中构建重组体(PGCsilencerTM-MDM2 siRNA)。实验分转染重组质粒组,转染阴性对照质粒组和只加脂质体的空白组;RT-PCR法观察U2OS细胞中MDM2-mRNA表达改变。结果成功构建发卡样MDM2siRNA真核表达载体(PGCsilencer TM-MDM2 siRNA);PGCsilencer TM-MDM2 siRNA转染到U2OS细胞后,MDM2-mRNA表达较空白组显著下降(P<0.05),转染阴性对照质粒组与空白组无显著差异(P>0.05)。结论成功构建PGCsilencerTM-MDM2 siRNA重组体,并能有效抑制U2OS细胞中MDM2-mRNA表达。

miR-645对骨肉瘤U2OS细胞生物学功能的影响

目的构建hsa-miR-645 inhibitor真核表达载体,观察miR-645在人骨肉瘤U2OS细胞中的表达及对细胞增殖、侵袭和对靶基因TNFR2表达的影响,并初步分析miR-645影响骨肉瘤细胞的可能机制。方法将hsa-miRNA-645 inhibitor基因克隆到真核表达载体pEZX AM02-U6 pur中,构建成pEZX AM02 645 inhibitor重组表达载体,将表达载体瞬时转染骨肉瘤U2OS细胞,RT-PCR法检测miR-645在转录水平的表达,MTT法检测细胞的增殖情况,Transwell法检测细胞的侵袭情况,生物信息学的方法预测miR-645的靶基因,并进行基因功能初步分析,化学发光法检测细胞中TNFR2表达的情况。结果真核表达载体pEZX AM02 645 inhibitor成功转染U2OS细胞,并经RT-PCR检测可有效表达,MTT法结果显示hsa-miR-645 inhibitor能明显抑制细胞增殖,Transwell法结果显示hsa-miR-645 inhibitor能降低细胞侵袭能力,报告基因检测结果显示TNFR2为miR-645在U2OS细胞中的作用靶点之一。结论构建了真核表达载体pEZX AM02 645 inhibitor,转染骨肉瘤U2OS细胞后能有效表达,并以TNFR2基因作为作用靶点。

Akt激酶抑制剂MK-2206诱导U2OS人骨肉瘤细胞凋亡与自噬

目的:研究Akt抑制剂MK-2206对U2OS细胞凋亡和自噬的影响。方法:采用MTT法检测MK-2206对U2OS细胞活力的影响,DNA片段末端标记试剂盒检测细胞凋亡的变化,免疫印迹法检测细胞内蛋白的表达,用LC3-II的表达量用来确定细胞的自噬水平。结果:MK-2206剂量依赖性地降低了U2OS细胞的活力;MK-2206能够促进caspase-9、caspase-3和PARP的活化切割而诱导U2OS细胞发生凋亡;MK-2206给药后可促进细胞内LC3-II的表达,氯喹阻断自噬后明显增强了MK-2206对U2OS细胞活力的抑制作用。结论:Akt抑制剂MK-2206能够诱导U2OS细胞发生凋亡和自噬;抑制自噬可促进MK-2206对U2OS细胞的毒性。

FHL2沉默对骨肉瘤U2OS细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨沉默FHL2表达对骨肉瘤U2OS细胞的增殖和凋亡的影响及其相关机制的研究。方法通过构建FHL2的shRNA干扰载体p LKO.1,制备慢病毒并感染U2OS细胞,分为sh FHL2目的基因干扰组(sh FHL2)和无关序列对照组(SCR);感染96 h后采用实时定量PCR(QPCR)和Western blotting检测两组FHL2 mRNA和蛋白水平。采用MTT方法检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期的变化,Western blotting检测FHL2干扰后U2OS细胞相关信号通路的蛋白表达变化。利用双荧光素酶报告基因系统检测FHL2对p53下游基因转录调控的影响。结果与SCR组比较,sh FHL2组感染96 h后FHL2 mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)。sh FHL2组感染24、48、72、96 h的细胞增殖比分别为1.73±0.08、2.49±0.38、3.26±0.45和4.28±0.29,其中96 h的细胞增殖比低于SCR组(P<0.05);sh FHL2组感染96 h的细胞凋亡率为(17.55±1.05)%,高于SCR组的(7.73±1.12)%,差异有统计学意义(P<0.05);sh FHL2组感染96 h的G_0/G_1期细胞为(68.18±0.78)%,高于SCR组的(59.73±2.28)%,差异有统计学意义(P<0.05)。干扰FHL2表达能够显著上调p53、p21和Bax的表达水平并能增强p53对Bax启动子的促转录活性。结论沉默FHL2表达可明显抑制骨肉瘤U2OS细胞增殖并促进细胞凋亡,使细胞阻滞于G_0/G_1期;FHL2介导了p53对Bax启动子的转录调节作用。FHL2可能会成为新的肿瘤治疗靶点,其机制与p53/Bax和p53/p21通路相关。

硫化氢抑制骨肉瘤U2OS细胞的体外生长

【目的】探讨硫化氢单独及与顺铂联用对骨肉瘤细胞生长的影响及其可能机制。【方法】分别用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L NaHS(硫化氢载体)单独或与20 mg/L顺铂共同作用骨肉瘤U2OS细胞24 h,CCK-8比色法法检测细胞存活率;分别用0.4及1.0 mmol/L NaHS作用骨肉瘤U2OS细胞24 h,1.0 mmol/L NaHS单独或与20 mg/L顺铂联用作用骨肉瘤U2OS细胞24 h,细胞单克隆形成法检测各组单克隆数;1.0 mmol/L NaHS与20 mg/L顺铂共同作用骨肉瘤U2OS细胞24 h,Western-Blot法检测Bcl-2、Bax、NFκB蛋白的表达。【结果】硫化氢对U2OS细胞生长的影响:0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L NaHS作用U2OS细胞24 h,细胞存活率与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);1、2、3、4、5 mmol/L NaHS作用U2OS细胞24 h,细胞存活率分别为(90.01±7.49)%、(88.00±4.12)%、(87.26±4.05)%、(85.40±4.39)%和(82.99±4.65)%,与对照组比较,能不同程度抑制U2OS细胞的生长(P<0.05)。0.4 mmol/L NaHS组、1 mmol/L NaHS组细胞单克隆数分别为445.00±25.00、306.00±17.69,与对照组(464.33±8.32)比较,1 mmol/L NaHS组细胞单克隆数减少(P<0.01);0.4mmol/L NaHS组差异无统计学意义(P>0.05)。NaHS与顺铂联用对骨肉瘤细胞的影响:分别用0.8、1、2、3、4、5 mmol/L NaHS联合20 mg/L顺铂共同作用U2OS细胞24 h,细胞存活率分别为(54.13±4.03)%、(54.09±1.13)%、(50.37±4.56)%、(41.44±3.95)%、(40.00±4.34)%和(36.35±3.90)%,与单用顺铂组(59.76±3.15%)比较,存活率下降(P<0.05)。NaHS+顺铂组细胞单克隆数为231.00±13.52,与顺铂组(285.67±11.59)比较,细胞单克隆数下降(P<0.01);NaHS+顺铂组NFκB蛋白表达及Bcl-2/Bax蛋白表达比值较顺铂组下降。【结论】1 mmol/L浓度以上的NaHS能抑制骨肉瘤细胞的生长,0.8 mol/L浓度以上的NaHS通过减少NFκB入核,增加细胞的凋亡,从而增强顺铂对骨肉瘤细胞的抑制作用。

三七总皂苷通过阻断Notch1通路抑制U2OS骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移并促进其凋亡

目的探讨三七总皂苷(PNS)对U2OS人骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭迁移生物学行为的影响及机制。方法培养U2OS人骨肉瘤细胞,采用(0、200、400、600、800、1000)μg/mL PNS处理细胞后,CCK-8法检测骨肉瘤细胞的增殖,异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡,集落形成实验检测细胞的集落形成能力,TranswellTM侵袭实验检测细胞侵袭、TranswellTM迁移实验和划痕愈合实验检测细胞迁移;Western blot法检测U2OS细胞缺刻基因1(Notch1)、发状分裂增强子1(Hes1)的蛋白表达。结果与对照组相比,PNS可以呈剂量依赖性抑制U2OS细胞的增殖与集落形成,细胞凋亡率增加,细胞侵袭、迁移能力减弱,细胞Notch1及Hes1的蛋白水平降低。结论PNS通过阻断Notch1的信号通路抑制U2OS骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移并促进其凋亡。

lncRNA HIT对骨肉瘤组织和细胞U2OS顺铂抵抗的影响及其机制

目的:探究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)HIT与骨肉瘤细胞顺铂(cisplatin,DDP)抵抗的关系及其上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的相关机制。方法:选择天津医院骨科2017年6月至2018年6月42例骨肉瘤组织及相应癌旁组织(距癌变边缘>5 cm)标本,采用qRT-qPCR检测骨肉瘤组织及相应癌旁组织中HIT及EMT标志物Snail、E-钙黏蛋白(E-cadherin)m RNA的表达水平。构建DDP抵抗的人骨肉瘤U2OS细胞株及人肾上腺293T细胞株作为抵抗组及对照组,采用慢病毒转染两组表达靶向HIT的siRNA载体于抵抗组细胞中作为干扰A组及B组,同时转染HIT过表达载体及空白载体构建HIT过表达的U2OS细胞株及空白U2OS细胞株分别作为过表达组及空白组。MTT实验检测各组细胞DDP半抑制浓度(IC_(50)),qRT-PCR实验检测各组细胞中HIT、Snail及E-cadherin mRNA的表达水平,Western blotting检测各组细胞Snail及Ecadherin的表达水平,RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA-IP)实验检测U2OS及293T细胞中HIT与Snail蛋白分子的结合情况。结果:骨肉瘤组织中HIT及Snail mRNA表达显著高于癌旁组织、E-cadherin mRNA表达显著低于癌旁组织,且骨肉瘤组织中HIT与E-cadherin mRNA表达呈显著负相关(均P<0.01);抵抗组细胞DDP IC_(50)显著高于对照组、干扰A组及B组细胞,过表达组DDP IC_(50)显著高于空白组(均P<0.01);抵抗组细胞HIT表达显著高于对照组,干扰A组及B组细胞HIT表达显著低于抵抗组及对照组,过表达组HIT表达显著高于空白组(均P<0.05或P<0.01);抵抗组细胞Snail、E-cadherin mRNA表达水平显著高于或低于对照组、干扰A组及干扰B组,过表达组E-cadherin mRNA显著低于空白组;抵抗组细胞Snail蛋白表达水平显著高于对照组、干扰A组及B组细胞,E-cadherin蛋白表达水平则显著低于对照组、干扰A组及B组细胞,过表达组Snail蛋白表达水平显著高于空白组(P<0.05或P<0.01);在U2OS及293T细胞中,免疫磁珠介导Anti-snail抗体下拉HIT的表达水平显著高于对照IgG抗体下拉HIT的表达水平(P<0.01)。结论:HIT通过正调控Snail蛋白水平,抑制E-cadherin的转录活性,从而促进骨肉瘤细胞EMT及DDP抵抗的发生。

含锌镁合金对人成骨肉瘤U2OS细胞株体外增殖的影响

背景:合金化可提高纯镁的抗腐蚀性能,延缓其降解速率;大量文献表明锌具有良好的抗肿瘤效果。目的:评价含锌镁合金对人成骨肉瘤U2OS细胞体外增殖及凋亡的影响。方法:检测纯镁及不同含锌量镁合金(质量分数2%、4%、6%)在Hank’s液中的氢气释放速率。取人成骨肉瘤U2OS细胞(或MC3T3-E1细胞),分别与不同含锌量镁合金浸提液、纯镁浸提液及钛合金浸提液共培养1,3,5 d,MTT法检测细胞增殖。取人成骨肉瘤U2OS细胞,分别与不同含锌量镁合金浸提液、纯镁浸提液及钛合金浸提液共培养24 h,流式细胞仪分析细胞凋亡,Western Blotting检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果与结论:①在初始的100 h内,纯镁组氢气释放速率明显高于含锌镁合金组;在不同含锌量镁合金组中,以含锌量4%镁合金组氢气释放速率最慢;②不同含锌量镁合金均可明显抑制人成骨肉瘤U2OS细胞的增殖,且与锌含量呈正相关;不同含锌量镁合金对MC3T3-E1细胞的毒性在0至1级之间;③不同含锌量的镁合金可明显促进人成骨肉瘤U2OS细胞的凋亡,且与锌含量呈正相关;④不同含锌量镁合金可上调人成骨肉瘤U2OS细胞p53、Bax蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达,改变Bcl-2/Bax比例,其中以含锌量4%镁合金效果最显著;⑤结果表明:含锌镁合金可抑制人成骨肉瘤U2OS细胞的体外增殖,诱导其凋亡。

穿心莲内酯对人骨肉瘤HOS和U2OS细胞株增殖、侵袭、迁移的影响及机制

目的探讨穿心莲内酯(AG)对人骨肉瘤HOS和U2OS细胞株增殖、侵袭及迁移的影响和机制。方法取对数生长期的人骨肉瘤细胞HOS、U2OS细胞株,分别予不含AG及10、20 mmol/L AG处理72 h,采用细胞增殖实验检测各组HOS、U2OS细胞0、24、48及72 h的吸光度,采用划痕试验和Transwell法分别检测各组HOS、U2OS细胞处理48 h的迁移能力和侵袭能力,采用Western blot检测各组HOS、U2OS细胞处理72 h的周期素依赖性激酶4(CDK4)和CDK6蛋白表达。结果20 mmol/L AG组HOS、U2OS细胞培养24、48及72 h的吸光度低于不含AG组和10 mmol/L AG组,差异均有统计学意义(P<0.05);20 mmol/L AG组HOS、U2OS细胞的侵袭数目及迁移率分别低于不含AG组和10 mmol/L AG组,差异均有统计学意义(P<0.05);20 mmol/L AG组HOS、U2OS细胞CDK4、CDK6蛋白水平分别低于不含AG组和10 mmol/L AG组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论AG可抑制人骨肉瘤HOS、U2OS细胞株的增殖、侵袭及迁移能力,其机制可能与调控细胞内CDK4、CDK6表达有关。

顺铂对人骨肉瘤U2OS细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的探讨顺铂(DDP)对人骨肉瘤U2OS细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法U2OS细胞用不同浓度(10、20、40μmol/L)DDP处理6、12、24、48、72 h,分别用划痕实验、CCK-8法、流式细胞术、Western blot观察细胞迁移、增殖、凋亡、凋亡相关蛋白变化。结果U2OS细胞迁移能力随DDP浓度增大、时间延长而降低。DDP作用24 h后,U2OS细胞生长活性随着DDP浓度增加而下降(P<0.01或0.05),而细胞凋亡率明显升高(P<0.01或0.05)。U2OS细胞凋亡相关蛋白cleaved-PARP、p-ERK/ERK、caspase-9、Bax表达随DDP浓度升高而增加(P<0.01),而Bcl-2表达减少(P<0.01)。结论DDP可抑制U2OS细胞增殖和迁移,并通过上调cleaved-PARP、p-ERK/ERK、caspase-9、Bax表达及下调Bcl-2表达促进细胞凋亡。

胡萝卜素诱导人骨肉瘤细胞U2OS自噬和凋亡的作用及机制

目的研究毒胡萝卜素(TG)诱导人骨肉瘤细胞U2OS自噬与凋亡的作用,并探讨两者发生以及相互关联的分子机制。方法用Lipofectamine 2000转染GFP-LC3表达质粒,通过荧光显微镜观察U2OS细胞荧光斑的形成,从而明确TG诱导细胞自噬的作用;用TG或同时联合3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理U2OS细胞后,检测自噬蛋白LC3的表达,各组细胞凋亡情况以及细胞形态改变。结果 TG可诱导U2OS细胞发生自噬,可见GFP-LC3融合蛋白聚集,形成绿色荧光斑点,3-MA可明显抑制TG诱导的自噬作用的发生;TG诱导U2OS细胞介导自噬的过程中LC3-II表达增高,同时TG可诱导U2OS细胞发生凋亡,在TG给药前用3-MA处理后会增强这种凋亡作用。结论 TG能抑制U2OS细胞的生长,并诱导其发生凋亡和自噬。TG诱导的自噬作为保护性机制,可发挥拮抗凋亡的作用。

新型磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91对骨肉瘤U2OS细胞增殖的抑制作用

目的研究高选择性的新型磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91对骨肉瘤的抗癌作用。方法CCK-8法检测不同浓度(0、20、40、80、160、240、320、400、480μmol·L^(-1))和不同干预时间(0、24、48、72、96 h)的ZL-n-91对U2OS细胞的增殖抑制作用;平板克隆形成实验检测ZL-n-91对U2OS细胞克隆形成能力的影响;流式细胞术检测细胞周期以及凋亡的影响;Western blot检测抗凋亡蛋白Bcl-2、周期蛋白CDK2、结果ZL-n-91明显抑制U2OS细胞的增殖,呈时间及剂量依赖性(P<0.05),其半数抑制浓度IC_(50)为174.1μmol·L^(-1);ZL-n-91明显抑制U2OS细胞的克隆形成能力(P<0.01);ZL-n-91影响U2OS细胞的周期进程,将U2OS细胞阻滞在G_(0)/G_(1)期,并明显促进细胞凋亡(P<0.01);Western blot结果显示ZL-n-91明显下调U2OS细胞中Bcl-2、CDK2、CDK4、CyclinD1、CyclinE1蛋白的表达(P<0.05)。结论新型选择性磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91显著抑制骨肉瘤细胞U2OS的增殖,促进细胞的周期阻滞和凋亡,可能是治疗骨肉瘤的潜在药物。

雷帕霉素对人骨肉瘤CD133^(+)U2OS细胞增殖和干性维持的影响

目的探讨雷帕霉素对人骨肉瘤CD133^(+)U2OS细胞增殖和干性维持的影响。方法(1)自U2OS细胞中分离CD133^(+)U2OS细胞,分为预对照组、低剂量雷帕霉素组和高剂量雷帕霉素组,分别加入含0 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL雷帕霉素进行培养。干预24 h、48 h、72 h后检测各组细胞的增殖抑制情况,然后选择适宜的干预剂量和时间进行后续试验。(2)将CD133^(+)U2OS细胞分为对照组和雷帕霉素组,分别使用不含雷帕霉素的培养基、含雷帕霉素的培养基培养。干预48 h后检测两组细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR及干性标志蛋白[SRY盒转录因子2(Sox2)、八聚体结合转录因子4(Oct4)]的相对表达量。结果(1)与预对照组相比,低剂量雷帕霉素组和高剂量雷帕霉素组细胞的增殖均受到抑制,且随着干预时间的延长和剂量的增加细胞增殖抑制率有增高的趋势(均P<0.05)。故在后续实验选择100 ng/mL雷帕霉素干预48 h。(2)雷帕霉素组mTOR、磷酸化mTOR、Sox2、Oct4的相对表达量均较对照组降低(均P<0.05)。结论雷帕霉素能够抑制人骨肉瘤CD133^(+)U2OS细胞的增殖和干性维持,这可能与其降低mTOR信号通路活性有关。