联合应用氯喹增加人胶质瘤细胞U343细胞对Bcl-2抑制剂ABT737的敏感性

目的探讨Bcl-2抑制剂ABT737联合氯喹的抗肿瘤作用。方法选用人胶质瘤细胞U343细胞系,应用MTT方法检测ABT737和(或)氯喹对U343细胞活性的影响,western blot检测ABT737和(或)氯喹对U343细胞凋亡通路相关蛋白的作用。结果 ABT737显著降低细胞生存率,增加U343细胞凋亡相关蛋白Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3及细胞色素C(cytochrome c)表达。当氯喹与ABT737联用时,二者联用与单用ABT737组相比,细胞活性显著降低,显著下调凋亡通路相关蛋白Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、细胞色素C表达。结论联用氯喹可提高人胶质瘤细胞U343细胞对Bcl-2抑制剂ABT737的敏感性。

裸鼠体内人U343胶质瘤中Period2对胶质瘤p53的调控作用及意义

目的探讨裸鼠体内Period2(Per2)基因对人U343胶质瘤细胞p53的调控作用及意义。方法体外培养特异性人Per2基因shRNA慢病毒载体转染细胞(shRNA-Per2组)、非干扰慢病毒载体转染细胞(shRNAcontrol组)、空白对照U343胶质瘤细胞(空白对照组),分别接种于裸鼠颈后皮下,处于标准饲养环境成瘤。qRT-PCR、Western blot技术分别检测shRNA-Per2组、shRNA-control组、空白对照组中胶质瘤Per2、MDM2、p53、ATM、c-myc的mRNA和蛋白含量。结果 Per2低表达加快裸鼠体内胶质瘤细胞的成瘤及肿瘤的生长,shRNA-Per2组胶质瘤中Per2、p53、ATM的mRNA含量均低于shRNA-control组和空白对照组(P均<0.05);而MDM2与c-myc的mRNA水平均高于shRNA-control组和空白对照组(P均<0.05);各个基因的空白对照组与shRNA-control组中mRNA表达差异无统计学意义(P均>0.05)。Western blot结果表明各组裸鼠体内胶质瘤中5种蛋白的表达与上述mRNA呈现相同的趋势。shRNA-Per2组胶质瘤中Per2蛋白表达(0.541±0.0516)低于shRNA-control组(0.854±0.0947)和空白对照组(0.787±0.0913)(P均<0.05),p53蛋白表达(0.707±0.126)低于shRNA-control组(1.160±0.0717)和空白对照组(1.300±0.105)(P均<0.05),ATM表达(0.364±0.0309)低于shRNA-control组(0.742±0.190)和空白对照组(0.719±0.175)(P均<0.05),而shRNA-Per2组胶质瘤中MDM2蛋白表达(0.777±0.145)高于shRNA-control组(0.520±0.0634)和空白对照组(0.483±0.096)(P均<0.05),c-myc蛋白表达(0.522±0.0624)高于shRNA-control组(0.280±0.0652)和空白对照组(0.237±0.0623)(P均<0.05)。而各个基因在空白对照组与shRNA-control组中相对蛋白表达水平差异无统计学意义(P均>0.05)。结论在胶质瘤发生发展中Per2基因促进p53和ATM的表达,降低MDM2和c-myc的表达;Per2可视为今后治疗胶质瘤的潜在靶点。

miR-128真核表达载体的构建及功能的初步研究

目的构建miR-128真核表达载体,研究其在神经胶质瘤细胞株U343表达及对U343细胞增殖的影响。方法以人神经胶质瘤细胞株U343的DNA为模板扩增miR-128-1和miR-128-2的前体序列,将人miR-128-1(hsamiR128-1)和人miR-128-2(hsa-miR128-2)基因克隆到真核表达载体pCR3.1,将pCR3.1-miR-128-1(p-128-1)和pCR3.1-miR-128-2(p-128-2)表达载体瞬时转染U343细胞,采用Northern印迹检测成熟的miR-128表达。将U343细胞接种96孔板,MTT法检测过表达miR-128对细胞增殖的影响。结果p-128-1和p-128-2表达载体经酶切及测序鉴定正确;二者转染细胞后,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增结果显示,其能有效表达miR-128的前体;Northern印迹结果均能产生成熟态的miR-128。MTT检测结果在无血清培养和维甲酸处理的情况下,细胞的增殖能力明显下降。结论成功构建了p-128-1和p-128-2的真核表达载体,转染神经胶质瘤细胞后能有效表达,miR-128基因过表达能抑制U343细胞的增殖。

SENP1、SENP2和SENP6蛋白在人恶性胶质瘤组织和细胞中的表达及其意义

目的:观察SUMO特异性蛋白酶(SENPs)家族成员SENP1、SENP2和SENP6在人恶性胶质瘤组织和细胞中的表达,阐明其在恶性胶质瘤发生中的作用。方法:取人脑正常组织和恶性胶质瘤组织样品分别作为正常对照组和恶性胶质瘤组;培养Cos7细胞和恶性胶质瘤LN443和U343细胞,Cos7细胞作为正常细胞对照组,LN443和U343作为恶性胶质瘤细胞组;采用Western blotting法检测SENP1、SENP2和SENP6蛋白在人恶性胶质瘤组织和细胞中的表达水平。结果:在脑组织中,与正常对照组比较,恶性胶质瘤组恶性胶质瘤组织中SENP1、SENP2和SENP6蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。在细胞中,与正常细胞对照组比较,恶性胶质瘤细胞组LN443和U343细胞中SENP1、SENP2和SENP6蛋白表达水平均明显升高(P <0.05)。结论:SENP1、SENP2和SENP6在恶性胶质瘤组织和细胞中高表达,其可能对恶性胶质瘤的发生起到了重要的促进作用。

Per2-shRNA慢病毒构建及嘌呤霉素筛选Per2低表达的细胞株

目的构建人Period2(Per2)基因shRNA慢病毒。方法设计并合成3对特异性人Per2基因shRNA靶序列,构建到pENTRTM/U6(GV112)慢病毒载体中,包装慢病毒,用real-time PCR筛选取最佳片段。对感染的U343细胞,经嘌呤霉素初步筛选,Western blot鉴定Per2蛋白表达,得到Per2低表达的细胞。结果成功构建了具有Per2沉默效应的shRNA慢病毒。结论此次包装的慢病毒可以成功抑制Per2基因在胶质瘤U343细胞中的表达,并可用嘌呤霉素筛选低表达细胞株。

MiR-27靶基因的分析及鉴定

MicroRNAs(miRNAs)是一类约20～25nt的小分子核苷酸,在细胞内的多种生物学过程,如细胞增殖、凋亡、生长、分化和代谢等过程中具有重要的功能。已知miR-27在脂肪细胞和肌肉细胞的发育过程中起了重要作用,其在神经细胞中的表达调节至今仍不清楚。在本研究中,通过miRBase和TargetScan数据库分析了miR-27的靶基因,构建了miR-27的真核表达载体,改造了萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶报告载体,将miR-27的靶基因Bmi1的3′-UTR融合到报告载体中,转染神经胶质瘤细胞,利用双荧光素酶检测系统分析荧光素酶的活性。研究发现miR-27a和miR-27b共同的靶基因主要调节发育过程。MiR-27真核表达载体能产生成熟态的miR-27。MiR-27a、miR-27b或miR-27a和miR-27b联合与Bmi1的3′-UTR的正义序列共转染U343细胞能明显降低萤火虫荧光素酶的活性(分别P<0.05,P<0.05,P<0.01),这提示了Bmi1可能为miR-27的靶基因。