槐定碱抑制人胶质瘤U87MG细胞株增殖及其作用机制研究

目的探讨槐定碱抑制人胶质瘤U87恶性胶质瘤(U87MG)细胞株增殖作用及其相关机制。方法将各个浓度的槐定碱加入到人胶质瘤U87MG细胞株中,应用四唑氮盐比色法测定槐定碱对肿瘤细胞生长的抑制作用,流式细胞仪测定槐定碱对U87MG细胞凋亡和细胞周期的变化,生化检验测定肿瘤细胞内活性氧簇(ROS)和谷胱甘肽(GSH)含量,实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹法分别检测肿瘤相关基因mRNA表达和蛋白表达的变化,荧光素酶报告基因法检测肿瘤细胞中泛素-蛋白酶体、叉头盒蛋白M1(FoxM1)、核转录因子kappa B(NF-kb)、激活子蛋白-1(AP-1)的活性的变化。结果槐定碱能够显著抑制细胞增殖,阻滞细胞周期在G2/M期;诱导细胞凋亡,引起ROS产生和GSH含量减少;促使p27、周期蛋白依赖性激酶2、Survivin、Livin、B淋巴细胞瘤-2、E2启动子结合细胞因子1等基因表达下调,同时上调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/8、p53、线粒体来源的第2个半胱氨酸蛋白酶激活剂、c-Jun氨基末端激酶和p38-丝裂原活化蛋白激酶等基因的表达;显著抑制泛素-蛋白酶体活性和FoxM1、NF-kb、AP-1的转录活性。结论槐定碱可能通过诱导细胞凋亡和ROS积聚,激活线粒体信号通路来发挥抗肿瘤活性。槐定碱能够作为一种新的药物来治疗胶质瘤。

HCMV感染对恶性胶质瘤U87细胞迁移及侵袭能力的影响

研究人巨细胞病毒(HCMV)感染对恶性神经胶质瘤U87细胞迁移及侵袭能力的影响。采用HCMV(MOI=5)感染神经胶质瘤U87细胞,Transwell体外迁移实验、Transwell体外侵袭实验检测HCMV感染对U87细胞迁移侵袭能力的影响;Western-blot检测肿瘤迁移、侵袭的标志性蛋白局部粘着斑激酶(FAK)及pTyr397FAK的表达变化。Transwell结果显示,HCMV感染U87细胞后迁移侵袭到小室膜下的细胞数量明显高于未感染组(P<0.05);Western-blot结果显示,HCMV感染组及对照组均出现FAK、pTyr397FAK蛋白的表达;HCMV感染组pTyr397FAK蛋白相对表达量高于对照组(P<0.05)。HCMV感染U87细胞通过促进FAK,Tyr397的磷酸化而促进胶质瘤U87细胞的迁移及侵袭。因此,抑制HCMV感染细胞后的FAK蛋白的磷酸化可以成为恶性胶质瘤预防及治疗的新靶点。

下调ATF5基因表达对神经胶质瘤细胞增殖及巨细胞病毒复制的影响

采用慢病毒介导的小RNA干扰技术,靶向干扰神经胶质瘤U87细胞中ATF5基因的表达,构建ATF5基因下调稳定表达的细胞株,并用Real-time PCR检测ATF5基因的下调表达效率。CCK8实验检测下调ATF5基因表达后对U87细胞增殖的影响;Semi-quantitative RT-PCR及Western-blot分别在mRNA、蛋白水平上检测下调ATF5的表达后对感染的HCMV复制的影响。研究结果显示,下调ATF5基因的表达可以抑制U87细胞的增殖,并且可以分别在mRNA、蛋白水平上抑制HCMV的复制。抑制U87细胞的增殖可以减慢神经胶质瘤的增长速度,抑制HCMV的复制可以减慢或者阻止神经胶质瘤恶性转化过程。由此可以推断出,下调ATF5基因的表达不仅可以直接抑制神经胶质瘤细胞的生长,还可以间接的抑制神经胶质瘤的发生发展。因此,下调ATF5的表达可能成为治疗神经胶质瘤的新的方法。

siRNA干扰半乳凝集素-3对恶性胶质瘤细胞株U87MG细胞凋亡及增殖的影响

目的研究抑制半乳凝集素-3(Gal3)的表达对恶性胶质瘤细胞株U87MG细胞凋亡及增殖的影响。方法构建Gal3siRNA表达载体,转染U87MG细胞,并筛选出单克隆细胞株U87MG/Gal3 RNAi;用RT-PCR方法检测该稳定细胞株中Gal3的mRNA表达,用Western blot检测其蛋白表达;通过流式细胞技术和MTT法检测Gal3对肿瘤细胞凋亡及增殖的影响。结果 U87MG野生型细胞株、U87MG/空载体稳定细胞株和U87MG/Gal3 RNAi稳定细胞株的Gal3 mRNA表达值分别为1.28±0.0431,1.31±0.0278和0.38±0.0506;Gal3蛋白表达值分别为0.56±0.0479,0.54±0.0351和0.12±0.0418,U87MG/Gal3 RNAi稳定细胞株的Gal3 mRNA及蛋白表达显著低于对照组细胞(P<0.05);三种细胞株对凋亡诱导剂CDDP所诱导的细胞凋亡率分别为(30.83±0.13)%、(30.82±0.159)%和(54.56±0.12)%,U87MG/Gal3 RNAi稳定细胞株凋亡率显著高于对照组细胞(P<0.05);U87MG/Gal3 RNAi稳定细胞株细胞增殖率在不同时间点均显著低于对照组细胞(P<0.05)。结论抑制Gal3基因的表达能够促进该肿瘤细胞的凋亡,并抑制细胞的增殖。Gal3可以成为治疗恶性胶质瘤的有效的靶基因。

高效液相色谱法测定U87细胞内外液中的阿霉素含量

目的:建立U87肿瘤细胞中阿霉素的高效液相色谱荧光检测方法,为进一步研究化疗药对肿瘤细胞功能和活性的影响及逆转耐药研究提供方法学基础。方法:U87细胞以1×106·mL-1密度与不同浓度阿霉素孵育24h为药物处理条件。将细胞分为空白对照组和加药组,采用HPLC法测定细胞内外阿霉素的含量。色谱柱为Inertsil ODS-3(250mm×4.6mm,5μm);流动相为甲醇-乙腈-0.01mol·L-1磷酸二氢铵(40∶15∶45)(以0.1%冰醋酸调整pH至3.52);柱温35℃,流速1.4mL·min-1,荧光检测器检测波长λex=495nm,λem=560nm,以盐酸柔红霉素为内标。结果:细胞内阿霉素在0.025～7.5mg·L-1范围内线性关系好,r=0.9999;细胞外阿霉素在0.1～10.0mg·L-1范围内线性关系好,r=0.9999。细胞内外液阿霉素的检测限均为0.005mg·L-1,细胞外液的定量限为0.1mg·L-1。日内、日间RSD均小于10%,样品稳定性好。结论:采用HPLC荧光法测定U87细胞内外液中阿霉素的含量,方法简单、准确、线形范围宽、灵敏度高、精密度好,可用于对培养的肿瘤细胞内外化疗药物浓度的动态变化规律研究。

过表达迁移侵袭抑制蛋白基因对人巨细胞病毒转染U87细胞特性影响

目的探讨过表达迁移侵袭抑制蛋白(MIIP)基因对人巨细胞病毒(HCMV)感染的神经胶质母细胞瘤U87细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。方法采用过表达的MIIP基因慢病毒转染HCMV感染的U87细胞,通过Western-blot检测其转染效率,并将细胞分为为实验组(U87+HCMV/MIIP)、对照组(U87+HCMV/CMV4)和空白组(U87+HCMV)。采用CCK-8检测过表达的MIIP基因对HCMV转染的U87细胞增殖情况的作用;采用Transwell迁移实验检测对细胞迁移情况的影响;采用Transwell体外侵袭实验检测对细胞侵袭能力的影响。结果实验组细胞的MIIP蛋白表达量与对照组和空白组比较,明显上调(P<0.05);细胞的增殖能力与对照组和空白组比较,明显降低(P<0.05);细胞的侵袭力与对照组和空白组比较,明显减弱,且细胞数显著下调(P<0.05);迁移能力与对照组和空白组比较,显著降低(P<0.05)。结论 HCMV感染的U87细胞在MIIP基因过表达后增殖、侵袭及迁移能力均受抑制。