U87-MG细胞中沉默NIN1/RPN12结合蛋白1同源物在宫颈癌及癌前病变中表达及其与高危型人乳头瘤病毒DNA负荷量相关性分析

目的探讨U87-MG细胞中沉默NIN1/RPN12结合蛋白1同源物(NOB1)在宫颈癌及癌前病变中表达及其与高危型人乳头瘤病毒(HPV)DNA负荷量相关性。方法选取2019年1月至2021年3月于本院就诊的120例宫颈病变患者作为研究对象,其中72例宫颈上皮内瘤病患者作为宫颈上皮内瘤病组,48例宫颈癌患者作为宫颈癌组;另选取同期50例体检的宫颈正常女性作为宫颈正常组。3组均进行NOB1检测及高危型HPV检测,比较3组宫颈组织中NOB1基因阳性表达率、高危型HPV DNA负荷量及阳性率,比较宫颈癌患者不同参数的NOB1基因和高危型HPV表达情况,分析NOB1基因阳性表达与高危型HPV DNA负荷量相关性。结果3组NOB1基因阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05);宫颈癌组NOB1基因阳性表达率高于宫颈癌上皮内瘤病变组、宫颈正常组,宫颈癌上皮内瘤病变组高于宫颈正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。3组高危型HPV DNA负荷量比较差异有统计学意义(P<0.05);宫颈癌组高危型HPV DNA阳性率高于宫颈癌上皮内瘤病变组、宫颈正常组,宫颈癌上皮内瘤病变组高于宫颈正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。宫颈癌患者组织学分级、淋巴结转移NOB1基因阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05);宫颈癌患者不同年龄、组织学类型、肌层浸润、分期的NOB1基因阳性表达率比较差异无统计学意义;宫颈癌患者不同年龄、组织学类型、组织学分级、肌层浸润、分期、淋巴结转移的高危型HPV DNA阳性表达率比较差异无统计学意义。Spearman相关性分析结果显示,宫颈癌患者NOB1表达与高危型HPV DNA负荷量呈正相关(r>0,P<0.05)。结论宫颈癌组织中NOB1基因阳性表达,可增加疾病恶性程度和淋巴结转移风险,与高危型HPV感染密切相关。

环孢素A增强三氧化二砷诱导的胶质瘤细胞U87-MG自噬性死亡

目的:探讨环孢素A(cyclosporine A,CsA)联合三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)对脑胶质瘤细胞U87-MG自噬性死亡的影响。方法:CsA联合ATO作用U87-MG细胞后,应用MTT法检测细胞的存活率及ATO半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50),FCM法检测细胞周期的改变,荧光显微镜下观察及FCM法定量分析经吖啶橙(acridine orange,AO)活体染色后细胞质内酸性自噬泡(acidic vesicular organelles,AVO)的形成情况;Western印迹法检测细胞自噬相关蛋白Beclin-1和自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达水平。结果:小剂量CsA(2μmol/L)联合ATO可明显抑制U87-MG细胞的生长,CsA可增加ATO诱导的细胞自噬性死亡,使ATO的IC50值由单独作用时的4.28μmol/L降低至联合作用时的1.28μmol/L;与对照组相比,CsA联合ATO作用后G2/M期细胞明显减少(P<0.05);AO活体染色可见,CsA联合ATO作用可显著增加细胞内的AVO形成,与CsA、ATO单独作用组相比差异有统计学意义(P<0.01);Western印迹可见CsA联合ATO作用后细胞内Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表达明显上调,与对照组和单独作用组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CsA可以增强ATO诱导的恶性脑胶质瘤细胞U87-MG的自噬性死亡,为恶性脑胶质瘤的治疗提供新的方向。

人U87-MG脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植模型的建立

目的应用不同数量U87-MG细胞接种裸鼠脑内,建立裸鼠脑胶质瘤模型,观察其生长特性。方法采用立体定向技术,分别将3.0×10^(10)·L^(-1)、4.0×10^(10)·L^(-1)、5.0×10^(10)·L^(-1)浓度的人脑胶质瘤细胞U87-MG单细胞悬液,接种于18只♂裸鼠的右侧尾状核区,每只接种体积为5μL,另取6只裸鼠作为对照,接种同体积Hanks液。观察不同接种量实验鼠的生存状态、成瘤情况及脏器转移灶、带瘤生存期,测量肿瘤的最大径,计算肿瘤体积,将获取的全脑标本制作病理切片,行HE染色和免疫组化检查。结果各接种量的实验组成瘤率均为100%,未见颅外转移病灶,3组裸鼠的平均生存时间分别为(46.50±3.27)d、(38.50±3.28)d、(30.67±3.51)d;病理学检查符合人脑胶质瘤细胞的形态学特征和免疫表型;免疫组化GFAP和S-100蛋白呈阳性表达。结论立体定向脑内定量注射U87-MG细胞制备的人脑胶质瘤裸鼠原位移植模型成瘤率高、颅内生长稳定、颅外远隔部位转移率低,与人脑胶质瘤病理学及形态学特征相似,能为研究胶质瘤的发生、发病机制、生物学特性以及探寻有效的治疗措施提供可靠的动物模型。

人U87-MG脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植模型的建立

目的建立成瘤率高、可靠稳定的人U87-MG脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植模型,为研究人脑胶质瘤的发病机制和治疗方法提供操作平台。方法采用立体定向技术,分别将2.5×105个/5μL体外培养的人脑胶质瘤细胞U87-MG单细胞悬液,接种于15只雄性裸鼠的右侧尾壳核区,另取6只裸鼠作为对照,接种同体积Hanks液。分别于接种后7,14,21,28 d行活体动物体内荧光成像和核磁共振扫描动态观察肿瘤大小,之后采用心脏灌注技术固定裸鼠脑组织,将获取的全脑标本制作病理切片,行HE染色和免疫组化检查。结果接种U87-MG的裸鼠均于造模后14 d开始脑内出现肿瘤,成瘤率100%,直至28 d肿瘤持续增长,35 d内该造模裸鼠全部死亡,平均生存时间(30.67±2.03)d;病理学检查符合人脑胶质瘤细胞的形态学特征和免疫表型;接种后14 d左右是利用该模型进行实验的最佳时机。结论立体定向脑内定量注射U87-MG细胞制作的人脑胶质瘤裸鼠原位移植模型,简便易行、经济实用、成瘤率高、重复性好、颅外远隔部位转移率低、与人脑胶质瘤病理学及形态学特征相似,能为研究胶质瘤的发生、发病机制、生物学特性以及探寻有效的治疗措施提供可靠的动物模型。

神经调节因子Neuregulin-1(Nrg1)调节U87-MG细胞的黏附分子L1表达及促迁移作用

目的研究神经调节因子Neuregulin-1(Nrg1)对人胶质母细胞瘤U87-MG细胞中细胞黏附分子L1表达及细胞迁移的影响。方法给予U87-MG细胞重组Nrg1α(rNrg1α,2.5 nmol/L)24和48 h,RT-PCR观察L1 mRNA表达;给予细胞rNrg1α或rNrg1β(2.5 nmol/L)48 h,Western blot检测L1蛋白水平。用Nrg1 siRNA处理细胞,Western blot观察L1蛋白水平,用细胞划伤实验观察细胞迁移。结果 Nrg1α可促进L1 mRNA表达;与0 nmol/L组相比,Nrg1α及Nrg1β(2.5 nmol/L)均可显著增加L1蛋白水平(P<0.01,P<0.05)。与对照siRNA相比,Nrg1 siRNA明显降低Nrg1表达,并伴有L1表达下降。Nrg1 siRNA处理细胞划伤16 h,划伤边缘细胞Nrg1α、Nrg1β及L1荧光信号降低,细胞迁移减弱。结论 Nrg1可调节U87-MG细胞L1表达,其参与细胞迁移可能与提高L1表达有关。

miR-370-3p对胶质母细胞瘤U87-MG细胞株增殖能力的影响

目的探讨微小RNA-370-3p(miR-370-3p)对人脑胶质瘤细胞系U87-MG增殖能力的影响及其机制。方法将常规培养的U87-MG细胞分为空白组、无义序列转染组和模拟物转染组,后两组分别转染miRNA无义序列及miR-370-3p模拟物,qRT-PCR法检测其转染效率,免疫印迹法检测转染细胞叉头框蛋白M1(FoxM1)的表达;采用Ed U法评估细胞的增殖能力,采用平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力。结果与空白组和无义序列转染组比较,模拟物转染组细胞miR-370-3p表达显著增加(P<0.05),而FoxM1的蛋白表达显著减少(P<0.05);而且模拟物转染组U87-MG细胞增殖能力及克隆形成率均明显减少(P<0.05)。结论 miR-370-3p能够抑制U87-MG细胞的增殖能力,可能与减少FoxM1的表达有关。

哇巴因调控Akt/mTOR信号通路诱导U87-MG细胞死亡的机制研究

目的探讨哇巴因(ouabain)对人胶质瘤U87-MG细胞死亡的影响及具体机制。方法将培养的U87-MG细胞随机分为正常对照(Control)组和ouabain组,分别加入常规培养基和不同浓度ouabain(0.05、0.5、2.5、25μmol/L)干预24 h,光学显微镜观察ouabain干预后24 h细胞的形态改变,MTT实验检测细胞活力,免疫印迹法(Western blot)检测Akt、p-Akt、m TOR和p-m TOR的表达变化。结果与Control组比较,ouabain显著降低U87-MG细胞活力(均P<0.01),且呈现浓度依赖性;高浓度ouabain(2.5、25μmol/L)与Control组相比能够降低U87-MG细胞中p-Akt、m TOR和p-m TOR的表达(均P<0.01)。结论高浓度ouabain可能通过抑制胞内Akt/m TOR信号通路,降低肿瘤细胞活力并最终引起细胞死亡。

哇巴因对人胶质瘤U87-MG细胞增殖及HIF-1α表达的影响

目的探索哇巴因(Ouabain)对人胶质瘤U87-MG细胞增殖和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的影响。方法Ouabain(0.05、0.5、2.5、25μmol/L)作用于U87-MG细胞24 h,MTT法检测吸光度值和细胞活力,Western Blot检测HIF-1α表达量。结果不同浓度Ouabain干预24 h后U87-MG细胞吸光度值(OD_(490))与Control组相比,均明显降低(P均<0.01),细胞活力显著下降(P<0.01);与Control组比较,0.05μmol/L Ouabain组HIF-1α蛋白表达量上升(1.27±0.05vs.1.00±0.05,P<0.05),当Ouabain浓度升高至2.5、25μmol/L,HIF-1α表达显著降低(0.28±0.04,0.20±0.03 vs.1.00±0.05,P均<0.01)。结论较高浓度Ouabain可通过抑制HIF-1α表达,促进人胶质瘤U87-MG细胞凋亡。

数字全息显微镜观察哇巴因对人胶质瘤U87-MG细胞的影响

目的应用数字全息显微镜观察哇巴因(ouabain)对人胶质瘤U87-MG细胞的影响。方法不同浓度ouabain(0.05、0.5、2.5、25μM)干预U87-MG细胞,24 h后使用光学显微镜观察细胞形态学改变,MTT法检测细胞活力,数字全息显微镜观察ouabain作用后细胞的动态变化和运动能力改变。结果与Control组比较,ouabain明显减低细胞活力[0.05μM(75.92±3.21)%,0.5μM(49.61±3.95)%,2.5μM(42.74±3.21)%,25μM(32.86±2.00)%vs.Control(100±0.01)%;P<0.01],减少细胞数量[0.05μM(170.7±4.7),0.5μM(162.3±4.4),2.5μM(142.0±2.6),25μM(110.3±1.2)vs.Control(193.7±2.6);P<0.05或P<0.01],并降低细胞运动能力[0.05μM(809.0±19.8)μm,0.5μM(626.9±23.5)μm,2.5μM(476.7±22.9)μm,25μM(386.5±19.6)μm vs.Control(959.7±18.9)μm;P<0.01],且呈浓度依赖性。结论 ouabain可抑制人胶质瘤U87-MG细胞的生长、降低肿瘤细胞运动能力并最终引起细胞死亡,数字全息显微镜可起到良好的评价作用。

TRPV2基因敲除对胶质瘤U87MG细胞增殖能力的影响

目的:探讨瞬时感受器电位离子通道蛋白V亚族2(TRPV2)基因敲除对胶质瘤U87MG细胞增殖及细胞周期进展的影响。方法:通过锌指核酶敲除U87MG细胞的TRPV2基因;Western Blot测定TRPV2蛋白的表达;Brdu掺入实验及Western Blot测定TRPV2基因敲除对U87MG细胞增殖的影响;流式细胞技术测定TRPV2基因敲除对U87MG细胞细胞周期进展的影响。结果:TRPV2蛋白在U87MG细胞中转录表达;靶向TRPV2的锌指核酶能有效地阻断U87MG细胞内TRPV2基因在蛋白水平上的表达。TRV2-/-U87MG细胞Brdu阳性率为(47.37±4.03)%,处于S期细胞的百分率为(20.14±0.47)%,均显著高于TRV2+/+U87MG细胞(P<0.01);PCNA表达量为U87MG TRV2+/+细胞的(1.47±0.19)倍(P<0.01)。结论:TRPV2基因敲除能明显促进U87MG细胞的增殖和细胞周期的进展。

红景天苷对胶质瘤U87-MG细胞增殖和侵袭能力的影响

目的观察红景天苷对胶质瘤U87-MG细胞增殖和侵袭能力的影响,探讨其诱导U87-MG细胞凋亡机制。方法不同浓度红景天苷和喜树碱加入U87-MG细胞中,作用24 h后,MTT法测定U87-MG细胞增殖,流式细胞术检测U87-MG细胞凋亡率,Transwell法检测U87-MG细胞侵袭能力,间接荧光标记法测定细胞内活性氧(ROS)水平,Western blot检测U87-MG细胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达。结果与空白对照组比较,各给药组U87-MG细胞生长抑制作用明显,10、50、100μg/m L红景天苷作用U87-MG细胞后,细胞侵袭能力显著下降,10、50、100μg/m L红景天苷作用U87-MG细胞48 h后均能诱导U87-MG细胞凋亡;ROS水平与红景天苷浓度呈正相关;10、50、100μg/m L红景天苷上调Caspase-3、Bax和E-cadherin的表达,下调Bcl-2和N-cadherin和MMP-9的表达。结论红景天苷可诱导U87-MG细胞凋亡、抑制U87-MG细胞的侵袭能力。

香青兰总黄酮对H_2O_2诱导的U87细胞损伤的保护机制研究

目的探讨香青兰总黄酮对过氧化氢(H_2O_2)诱导的U87细胞损伤的保护作用,以及ERK/MAPK信号通路在该过程中的作用机制。方法以正常培养的U87细胞为正常对照组,U87细胞加入0.31 mmol/L的H_2O_2损伤20min为模型组,采用不同浓度香青兰总黄酮(200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56μg/mL)预给药U87细胞2h,分别加入0.31mmol/L的H_2O_2刺激U87细胞20min作为实验组,采用CCK-8法检测U87的增殖活力,用ROS检测试剂盒法对活性氧(ROS)含量进行测定,Western blot法检测P-ERK1/2、ERK1/2蛋白的表达水平。结果与模型组比较,实验组细胞增殖活力提高,差异有统计学意义(P<0.05),与模型组相比,实验组细胞ROS含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot实验表明,与模型组比较,香青兰总黄酮不同浓度(100、50、25、5μg/mL)实验组P-ERK1/2蛋白含量均高于模型组,且呈现剂量依赖,差异有统计学意义(P<0.05)。结论香青兰总黄酮通过激活P-ERK1/2通路,抑制ROS过量产生,起到拮抗H_2O_2对U87细胞增殖的抑制作用。

过表达TRAIL转基因人脐带间充质干细胞治疗裸鼠脑胶质瘤的研究

目的探讨建立转座子载体过表达外源肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的人脐带来源间充质干细胞(hUC-MSCs)转基因细胞系及其应用于脑胶质瘤裸鼠模型的疗效。方法自主专门设计的PiggyBac转座子过表达系统,通过嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选制备稳定表达TRAIL基因的靶向HER2型和非靶向型的2种转基因细胞。将带有萤火虫荧光素酶标记的脑胶质瘤细胞(U87MG-FLUC)接种于免疫缺陷性小鼠(BALB/c-nu/nu)颅内,接种剂量为1×10^(6)个/只,接种7 d后利用小动物活体成像仪对植瘤小鼠脑颅检测,确定颅内肿瘤的大小和位置,然后将胶质瘤裸鼠分为4组(n=8),分别注射2种表达TRAIL转基因hUC-MSCs(分别命名为target-TRAIL和untarget-TRAIL组),以及只注射非转基因hUC-MSCs(接种剂量均为1×10^(6)/只)或PBS(分别命名为WT-MSCs和PBS组,作为阴性对照),每周用小动物活体成像仪监测肿瘤信号的变化情况,约检测34周。结果2种转基因细胞经过6次传代扩增后能稳定表达TRAIL基因,流式检测:绿色荧光蛋白(GFP)阳性(共表达TRAIL基因)的细胞比例达到93%97%,且经过6次传代后均为MSC相关表面标志物CD34、CD45、HLA-DR阳性率<0.1%,CD90阳性率>99%,CD73阳性率>98%,CD105阳性率>60%。中位生存期(d):胶质瘤裸鼠经颅内注射untarget-TRAIL、target-TRAIL、WT-MSCs或PBS组分别为41 vs 39 vs 24 vs 23(P<0.05)。结论过表达TRAIL转基因的hUC-MSCs-TRAIL细胞明显延长移植了脑胶质瘤的裸鼠的生存时间。

染料木素衍生物对U87-MG细胞凋亡机制的研究

目的:研究染料木素衍生物(Ged)对U87-MG细胞的凋亡机制。方法:实验分为对照组,染料木素衍生物组(10、20、40μmol·L^(-1));以MTT法检测细胞体外抗增殖活性,流式细胞仪检测细胞的凋亡状况,荧光定量PCR仪检测细胞内Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA水平,激光共聚焦检测线粒体膜电位变化和活性氧含量,酶标仪检测Caspase-3酶的活性。结果:随染料木素衍生物浓度的增加,对U87-MG细胞的抑制性增强,细胞的凋亡量成浓度依赖性,IC50为20.23μmol·L^(-1);荧光定量PCR结果显示,Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、Cyt c、Caspase-3 mRNA的基因表达水平显著增加(P<0.05);当浓度为20μmol·L^(-1)时,线粒体膜电位降低显著;随着细胞的凋亡,活性氧的生成也与药物浓度呈依赖性;Caspase-3酶的活性在药物浓度为40μmol·L^(-1)时,达到极显著水平(P<0.01)。结论:染料木素衍生物(Ged)能抑制U87-MG细胞的增殖,增强活性氧的簇产生、线粒体膜电位下降,随细胞凋亡量的增加,Caspase-3酶的活性增强,染料木素衍生物具有较强的抗癌活性。

CREB3通过下调FAK磷酸化水平抑制胶质瘤细胞增殖及侵袭转移的体外实验研究

目的研究环磷酸腺苷反应原件结合蛋白3(CREB3)基因与胶质瘤患者的生存预后相关性,以及其在胶质瘤细胞增殖及侵袭转移等恶性生物学行为中的功能作用及发生机制,为寻找有效的胶质瘤分子治疗靶点提供理论依据。方法CREB3的mRNA表达水平及其存活率来自中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)数据库。免疫组化(IHC)验证在不同级别的人脑胶质瘤组织中CREB3和磷酸化部黏着斑激酶397位点(p-FAK397)蛋白的表达情况。慢病毒构建U87、U251的CREB3的敲低模型。利用蛋白质印记技术(WB)验证p-FAK和其通路上相关蛋白以及相关凋亡蛋白的表达情况。使用细胞增殖实验(CCK-8)计算细胞在450 nm出的光密度(OD)及平板克隆实验验证敲低慢病毒敲低CREB3后细胞的增殖能力,利用细胞划痕,Transwell实验验证敲低细胞系的迁移和侵袭的能力。结果根据CGGA数据库,发现CREB3在高级别胶质瘤中表达上调,提示预后不良(P<0.05)。IHC表明随着胶质瘤级别的增高CREB3表达随之增加,而p-FAK(397)则在Ⅳ级胶质瘤中明显表达。构建慢病毒敲低CREB3的U87、U251细胞系通过WB表明可以使p-FAK(397)的表达下降,促凋亡蛋白(BAX)表达增加,抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达减少(P<0.05),并且可以在体外抑制胶质瘤的增殖、迁移和侵袭(P<0.05)。结论CREB3在高级别胶质瘤组织中表达增高,且与患者生存预后密切相关。敲低CREB3下调胶质瘤细胞中FAK的磷酸化水平,进而介导胶质瘤细胞的增殖及侵袭迁移能力变弱。

木犀草素联合替莫唑胺治疗脑胶质瘤及其机制的研究

目的:探讨木犀草素联合替莫唑胺治疗脑胶质瘤的效应,并阐明木犀草素的低毒性和抑制作用机制。方法:利用MTT法测定木犀草素和替莫唑胺对脑胶质瘤细胞系U87-MG和人正常脑细胞细胞生长的抑制作用,并利用荧光染色法检测细胞形态的变化;分光光度法检测木犀草素对细胞凋亡蛋白caspase-3活性,采用Transwell小室法分析木犀草素和替莫唑胺对U87-MG细胞转移能力;采用非放射性NF-κB EMSA试剂盒测定U87-MG细胞中NF-κB表达。结果:随着木犀草素和替莫唑胺浓度的增加,U87-MG细胞生长抑制率从(0.08±0.01)%分别增加到(87.30±8.45)%和(81.94±7.32)%,木犀草素和替莫唑胺对的半抑制率IC50分别为(30.54±2.98)和(32.79±3.08)μmol/L;但木犀草素作用下的正常脑细胞的生长并未受到明显的抑制。木犀草素与替莫唑胺联合使用时,对U87-MG细胞的生长抑制起到了良好的协同作用;与空白对照组比较,木犀草素和替莫唑胺存在下的U87-MG细胞的侵袭能力从(100.36±8.91)%分别降到了(15.48±1.23)和(27.66±2.76);U87-MG细胞中凋亡蛋白caspase-3相对活性增加了(90.44±5.61)%,并能够NF-κB信号的表达下调了(89.64±6.77)%。结论:低毒性的木犀草素可能通过下调NF-κB信号通路和激活凋亡caspase-3酶联反应的方式对U87-MG细胞的侵袭、增殖产生抑制作用,并与低浓度的替莫唑胺联合使用有良好的协同作用。